苯扎貝特對原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血CD4+T細(xì)胞的抑制作用研究①

陳曲波 彭桉平 黎翠翠 趙 蓉 盧欣沂 何 敏 周麗敏 吳煒霖

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院免疫室，廣州 510120)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是由自身免疫機(jī)制介導(dǎo)的，以肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性、非化膿性炎癥為特征的慢性膽汁淤積性疾病，并進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，最終導(dǎo)致肝功能衰竭。盡管PBC的病因和發(fā)病機(jī)制還不清楚，但有許多證據(jù)表明自身反應(yīng)性T細(xì)胞參與發(fā)病，并對膽小管破壞起重要作用。研究顯示在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者肝臟組織存在顯著的T細(xì)胞浸潤，尤其在匯管區(qū)浸潤的T細(xì)胞中以CD4+T細(xì)胞為主，表現(xiàn)為增強(qiáng)的Th1、Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)及低下的Treg細(xì)胞反應(yīng)［1］。傳統(tǒng)降脂藥苯扎貝特能降低PBC患者外周血Fas抗原陽性 T細(xì)胞的比率，具有一定程度的抗炎作用［2］。一些對熊去氧膽酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)耐藥的PBC患者使用BF單一療法，有50%可達(dá)到很好療效，且UDCA聯(lián)合BF治療可使大多數(shù)病人的生化和免疫指標(biāo)達(dá)到正常水平，明顯改善臨床癥狀，且沒有任何的副作用，故BF聯(lián)合UDCA可能對UDCA耐藥的PBC患者是一種有效的治療方法［3］，但其免疫抑制機(jī)制不清楚。本研究通過BF體外干預(yù)PBC患者CD4+T細(xì)胞增殖和分化，闡述其免疫抑制作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用BF提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 PBC患者15例，女性12例，男性3例，平均年齡(66.5±16.8)歲，均來自2010年12月至2011年10月就診于廣東省中醫(yī)院的門診或住院病例。PBC組入選標(biāo)準(zhǔn)參考2009年歐洲和美國同時(shí)制定的新指南:①臨床出現(xiàn)膽汁淤積癥狀，如黃疸、皮膚瘙癢、疲勞等;②AMA≥1∶40，尤其是AMAM2陽性，有膽汁淤積的生物化學(xué)改變(ALP和GGT升高且無其他原因)，B超檢查膽道系統(tǒng)正常;③肝活組織檢查符合PBC改變。符合上述三項(xiàng)可確診為PBC，符合前兩項(xiàng)者但未進(jìn)行肝活組織檢查視為可疑PBC。所有患者臨床表現(xiàn)各異，肝功能指標(biāo)中ALT、AST、GGT、ALP 及 TBA 均明顯異常，均無其他肝臟相關(guān)疾病及自身免疫性疾病。

1.2 CD4+T細(xì)胞的分選和培養(yǎng) 收集患者外周肝素抗凝血15 ml，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。采用德國Miltenyi公司磁珠分選試劑盒分選CD4+T細(xì)胞，分選純度大于97%。將分選的CD4+T細(xì)胞加入RPMI1640培養(yǎng)液，以細(xì)胞數(shù)為2×105L－1的細(xì)胞懸液加入到96孔 U型板中，在anti-CD3(1 μg/ml)和anti-CD28(1 μg/ml)的刺激條件下，加入不同濃度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)。于 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，于不同時(shí)間收集細(xì)胞或上清進(jìn)行下續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CD69和CD25表達(dá)水平檢測 分別于CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)36 h及72 h后，收集細(xì)胞檢測CD69及CD25分子表達(dá)。收集細(xì)胞，離心(1 500 r/min，5 min)，制成細(xì)胞懸液，加入抗人FITC-CD69抗體或抗人PE-CD25抗體表面染色，4℃避光孵育30 min，洗滌(1 500 r/min，5 min)染色細(xì)胞重懸，采用BD CantoⅡ流式細(xì)胞檢測儀檢測，F(xiàn)ACS Diva6.0軟件分析流式檢測結(jié)果。流式抗體購自美國eBioscience公司。

1.4 CFSE標(biāo)記CD4+T細(xì)胞 將分選的CD4+T細(xì)胞加入RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×106/L－1，將CFSE加入細(xì)胞懸液中(終濃度5 μmol/L)，加入不同濃度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)，培養(yǎng) 7 d。培養(yǎng)第1天起在各孔均加入 anti-CD3(1 μg/ml)、anti-CD28(1 μg/ml)。于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，隔2 d換液，采用BD CantoⅡ流式細(xì)胞檢測儀檢測CD4+T細(xì)胞增殖情況。

1.5 IL-17和IFN-γ水平檢測 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按北京達(dá)科為有限公司ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

1.6 IL-17和IFN-γ胞內(nèi)水平檢測 將培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞在刺激劑PMA、Inomycin與monensin刺激下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。收集上述培養(yǎng)后的細(xì)胞，離心(1 500 r/min，5 min)，制成細(xì)胞懸液，加入抗人PECY7-CD4抗體表面染色，4℃避光孵育30 min，洗滌(1 500 r/min，5 min)，固定破膜。加入抗人 FITC-IL-17、APCIFN-γ抗體胞內(nèi)染色，4℃避光孵育30 min，離心洗滌(1 500 r/min，5 min)，cell staining buffer重懸，采用BD CantoⅡ流式細(xì)胞檢測儀檢測，F(xiàn)ACS Diva6.0軟件分析流式檢測結(jié)果。流式抗體購自美國ebioscience公司。

2 結(jié)果

2.1 BF抑制PBC患者CD4+T細(xì)胞活化 PBC患者CD4+T細(xì)胞在anti-CD3和anti-CD28單抗的刺激條件下，加入不同濃度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)培養(yǎng)后，F(xiàn)CM檢測早期活化抗原CD69和中期活化抗原CD25表達(dá)情況。結(jié)果表明(圖1)，隨著BF濃度的增加，CD69和CD25的表達(dá)率均相應(yīng)地下降，尤其在100 μmol/L的BF干預(yù)濃度下，兩者的表達(dá)抑制率均達(dá)到10%左右，進(jìn)一步提示了BF呈濃度依賴性地部分抑制CD4+T細(xì)胞的早中期活化。

2.2 BF抑制PBC患者CD4+T細(xì)胞增殖 CFSE標(biāo)記的PBC患者CD4+T細(xì)胞在anti-CD3和anti-CD28單抗的刺激條件下，加入不同濃度的BF(0、10、50、100 μmol/L)進(jìn)行培養(yǎng) 7 d，F(xiàn)CM 檢測CD4+T細(xì)胞增殖。結(jié)果表明(圖2)，無BF干預(yù)時(shí)，CD4+T細(xì)胞增殖明顯(7代)，其增殖率隨著BF干預(yù)濃度增加而降低，50 μmol/L明顯抑制CD4+T細(xì)胞增殖。

2.3 BF抑制PBC患者CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-γ表達(dá) ELISA法檢測未處理組及BF處理組中IL-17和IFN-γ水平差異，顯示BF處理組中IL-17和IFN-γ水平較未處理組明顯降低(圖3，P＜0.05)。

圖1 BF抑制PBC患者CD4+T細(xì)胞CD69和CD25的表達(dá)Fig.1 Expression of CD69 and CD25 on CD4+T cells of PBC patients by bezafibrate suppressing

圖2 BF抑制PBC患者CD4+T細(xì)胞增殖Fig.2 Inhibition efficiency of bezafibrate on CD4+T cells proliferation in PBC patients

圖3 BF抑制PBC患者CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-γ表達(dá)Fig.3 Expression of IL-17 and IFN-γ in CD4+T cells culture supernatants of PBC patients by BF suppressing

2.4 BF 抑制 PBC 患者 IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和IFN-γ－IL-17+CD4+T細(xì)胞各亞群細(xì)胞因子分泌 CD4+T細(xì)胞在anti-CD3和anti-CD28單抗刺激條件下，根據(jù)IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生情況，可以將CD4+T細(xì)胞分為3個(gè)不同亞群，分別為IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和 IFN-γ－IL-17+細(xì)胞，而 BF 對各亞群細(xì)胞因子分泌都有不同程度的抑制，且呈濃度依賴性(圖4，P ＜0.05)。

3 討論

圖4 BF抑制PBC患者CD4+T細(xì)胞各亞群細(xì)胞因子(IFN-γ+IL-17－/IFN-γ+IL-17+/IFN-γ－IL-17+)的分泌Fig.4 Flow cytometry analyzed CD4+T cells subgroup cytokine secretion in PBC patients by BF suppressing

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)除參與脂質(zhì)和葡萄糖代謝外還可參與炎癥反應(yīng)，PPARs屬于核受體，是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，在特定配體激活下，可抑制多種炎癥因子的表達(dá)。BF是非選擇性的脂質(zhì)PPARs激動(dòng)劑，兼而具有激動(dòng)PPARα、PPARδ、PPARγ的作用，其中以α亞型親和力最高。近年國外臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)BF對PBC患者也有一定臨床療效，對UDCA耐藥的PBC患者單用或聯(lián)合使用BF，可明顯改善臨床癥狀，可能是BF能通過PPARα增加多重耐藥基因(MDR3)表達(dá)和誘導(dǎo)MDR3-P糖蛋白的表達(dá)，使磷脂分泌到膽汁，與疏水膽汁酸形成膠體對膽管上皮起保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)理不明。故本文著重以PBC患者為研究對象，探討B(tài)F治療PBC的某些機(jī)制。

PBC是以肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性、非化膿性炎癥為特征的自身免疫疾病，其病因和確切發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，目前認(rèn)為CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)在PBC發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。CD4+T細(xì)胞的異?；罨驮鲋吃赑BC發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。故而抑制其活化和增殖對于PBC的治療具有重要意義。在T細(xì)胞的活化中，CD69不僅是它的早期活化標(biāo)記分子，還可作為細(xì)胞的共刺激信號進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞的增殖分化［4］;CD25作為T細(xì)胞中期活化分子，是IL-2受體(IL-2R)α鏈，可與IL-2Rβ鏈、IL-2Rγ鏈組成IL-2R，進(jìn)一步與IL-2結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖分化［5］。CD69和CD25作為T細(xì)胞不同時(shí)期的活化標(biāo)記，可反映T細(xì)胞的活化水平，兩者在BF的干預(yù)下均出現(xiàn)表達(dá)的下調(diào)，從而表明BF可抑制CD4+T細(xì)胞的活化。而T細(xì)胞活化是早期免疫應(yīng)答的重要表現(xiàn)，選擇性阻斷T細(xì)胞異常活化可進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的增殖分化，阻止其介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，因此，本研究還采用活體染料CFSE標(biāo)記追蹤PBC患者CD4+T細(xì)胞增殖，顯示BF對PBC患者外周血分離的經(jīng)抗CD3/CD28刺激的CD4+T細(xì)胞的增殖具有抑制作用，提示BF可通過抑制CD4+T細(xì)胞的活化增殖來抑制PBC患者體內(nèi)異常的免疫反應(yīng)。

CD4+T細(xì)胞根據(jù)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子不同而分為不同的亞群，分別為Th1、Th2及Th17。Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng);Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，參與體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng);Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，在防御胞外菌感染、介導(dǎo)慢性炎癥以及自身免疫病中發(fā)揮重要作用［6-11］。目前已發(fā)現(xiàn)許多Th1與Th17細(xì)胞因子的表達(dá)水平與PBC患者的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，活動(dòng)性PBC患者外周血Th細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和/或IL-17的水平明顯升高。而來自臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示，IFN-γ和/或IL-17在PBC致病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用［12］。而Th17細(xì)胞又可進(jìn)一步分為表達(dá)IL-17+IFN-γ+和IL-17+IFN-γ－兩類細(xì)胞群，表達(dá) IL-17+IFN-γ+的Th17/Th1細(xì)胞在近年研究中也備受關(guān)注。已在小鼠模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Th17/Th1比只分泌IL-17的Th17細(xì)胞更具致病性［13］。而在PBC患者中這兩類細(xì)胞群誰起最主要的致病作用，還是都起作用還需進(jìn)一步的證明。ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)BF呈濃度依賴抑制PBC患者外周血CD4+T細(xì)胞IL-17和IFN-γ的分泌，進(jìn)一步流式結(jié)果顯示BF抑制CD4+T細(xì)胞中IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和 IFN-γ－IL-17+各亞群細(xì)胞的分化，提示BF抑制Th1及Th17細(xì)胞分化和其細(xì)胞因子釋放，可能有助于緩解PBC急性期及慢性期過度的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。然而BF抑制IFN-γ在50 μmol/L與100 μmol/L濃度差異有顯著性，而對IL-17抑制50 μmol/L與100 μmol/L濃度差異無顯著性，提示BF可能是通過不同的作用途徑影響CD4+T細(xì)胞分化與細(xì)胞因子分泌。

總之，本研究從活化增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞分化等多方面檢測了BF對PBC患者CD4+T細(xì)胞的干預(yù)作用，顯示BF可通過抑制CD4+T細(xì)胞活化增殖、細(xì)胞因子的分泌及Th1、Th17細(xì)胞分化發(fā)揮免疫抑制作用。為臨床上應(yīng)用BF治療PBC提供新的理論依據(jù)。

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