補(bǔ)腎固沖方逆轉(zhuǎn)Th1/Th2 亞群失衡治療URSA 作用與機(jī)制研究①

彭 莉 賴楠楠 王東梅 郭 菲 王 麗 郭鈺琪 姚成芳 張洪海 李 霞

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東省腫瘤醫(yī)院，濟(jì)南 250117)

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)是自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生2次或2 次以上，其發(fā)病率約為妊娠總數(shù)的0.5%～1.0%［1］。RSA 發(fā)病原因復(fù)雜，除內(nèi)分泌因素、解剖因素、染色體因素外，約40%～80%病因不明，稱為原因不明性復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(URSA)［2］。URSA 嚴(yán)重危害育齡婦女生殖健康，且患者再次發(fā)生流產(chǎn)概率隨既往流產(chǎn)次數(shù)增加而升高。隨著生殖免疫學(xué)研究的不斷深入，母胎免疫耐受機(jī)制在URSA 發(fā)病中的作用日益受到關(guān)注［3］。妊娠猶如成功的同種異體移植，母胎免疫耐受在其中發(fā)揮著重要作用。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的主體，在誘導(dǎo)與維持母胎免疫耐受中扮演著重要角色，其亞群失衡在妊娠相關(guān)疾病中作用日益受到關(guān)注［4］。目前URSA 治療主要采用非特異性免疫抑制劑、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)輸?shù)确椒?，但存在療效不穩(wěn)定、副作用大、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。中醫(yī)藥毒副作用小、安全有效，治療URSA 有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。補(bǔ)腎固沖方(BSGCF)是臨床治療URSA 的有效方劑，但其治療靶點(diǎn)與作用機(jī)制尚未明確。本研究觀察補(bǔ)腎固沖方治療前后URSA 患者Th1/Th2 亞群分化狀態(tài)，并分析其療效相關(guān)性，進(jìn)一步揭示URSA 的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理，闡釋補(bǔ)腎固沖方逆轉(zhuǎn)Th1/Th2 亞群失衡治療本病的作用與分子機(jī)制，為精確指導(dǎo)臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 入選標(biāo)準(zhǔn):URSA 診斷依據(jù)［5］:(1)患者有2 次或2 次以上自然流產(chǎn)史，無活產(chǎn)史;(2)夫婦雙方和(或)胚胎染色體正常，無家族遺傳病及近親結(jié)婚史;(3)婦檢白帶檢查、超聲檢查和(或)子宮輸卵管造影等檢查排除患者器質(zhì)性病變、生殖器官解剖畸形及感染性因素;(4)月經(jīng)周期正常，基礎(chǔ)體溫雙相，超聲監(jiān)測(cè)排卵正常;(5)男方精液分析正常;(6)性激素、甲狀腺功能、血糖、胰島素等內(nèi)分泌檢查均正常;(7)自身抗體如抗核抗體、抗心磷脂抗體、抗甲狀腺抗體、抗2-糖蛋白Ⅰ抗體檢查均呈陰性;(8)血栓前狀態(tài)有關(guān)的檢查，包括D-二聚體、纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物、血凝系列、全血分析均正常;(9)Torch 系列IgM 均陰性;(10)以往未進(jìn)行過主動(dòng)免疫治療。正常對(duì)照納入標(biāo)準(zhǔn):妊娠12 周以內(nèi)正常妊娠查體婦女，年齡＜40 歲;既往無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，無遺傳、解剖、內(nèi)分泌方面異常，無感染、自身免疫性疾病史;本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產(chǎn)癥狀和體征;超聲證實(shí)胚胎發(fā)育正常，有心管搏動(dòng)。

所有病例為2013 年1 月至12 月在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診及病房就診的30 例URSA 患者，年齡＜40 歲，平均(26.7±3.2)歲，孕周約(7.5±1.6)周;選擇同期就診于我院婦科查體的正常早孕婦女30 例作為正常對(duì)照組，平均(25.7±3.4)歲，孕周約(7.2±1.5)周;兩組的年齡與孕周均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 研究藥物 補(bǔ)腎固沖方，由菟絲子(Semen Cuscutae Chinensis)、桑寄生(Herba Taxilli)、阿膠(Colla Corii Asini)、陳皮(Pericarpium Citri Reticulatae)、杜仲(Eucommia ulmoides)、黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)、白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz)、甘草(liquorice root)，按照5∶5∶4∶4∶3∶3∶2∶2比例組成，常規(guī)法水煎、醇沉，回收乙醇，濃縮藥物濃度為1.95 g/ml，滅菌后真空包裝，4℃保存。

1.3 方法

1.3.1 服藥方法 URSA 組患者早晚各服用補(bǔ)腎固沖方提取液20 ml，連服14 d;正常對(duì)照組不服藥。

1.3.2 標(biāo)本收集與保存 抽取正常妊娠組、實(shí)驗(yàn)組治療前及末次服藥次日患者外周靜脈血5 ml，EDTA-2Na 抗凝，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，分別用于流式抗體標(biāo)記及RT-PCR 檢測(cè)。

1.3.3 標(biāo)本檢測(cè)

1.3.3.1 主要試劑 大鼠抗人熒光抗體:FITCCD4、PE-IL-IFN-γ、PE-IL-4 均購自美國BD Pharmigen 公司，M-MLV 購于MBI 公司，RNA 酶抑制劑購于BioBasic 公司，GIT、DEPC、Agarose 為AMRESCO公司產(chǎn)品;氯仿、異丙醇、無水乙醇均購于天津廣成化學(xué)試劑有限公司。內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、T-bet、GATA-3 引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.3.3.2 流式抗體標(biāo)記與檢測(cè) 收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106個(gè)/ml，加入佛波酯30 μg/L、離子霉素(Ionomycin)1 mg/L、莫能霉素(Monensin)1.7 μg/L，37 ℃，5% CO2孵育4 h。收集細(xì)胞，1 ×PBS 洗2 遍，去上清，加入大鼠血清，室溫避光孵育30 min。將外標(biāo)抗體FITC-CD4 按說明書加入到細(xì)胞懸液中，4℃避光孵育30 min;1 ×PBS洗2 遍，去上清;BD 固定穿膜試劑盒固定穿膜(按說明書操作)，加入內(nèi)標(biāo)抗體(PE-IFN-γ、PE-IL-4)，4℃避光孵育30 min;穿膜緩沖液洗2 次，去上清，PBS 重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)管，上機(jī)檢測(cè)。Winmidin 2.9 分析Th1(CD4+IFN-γ+)及Th2(CD4+IL-4+)亞群比例。

1.3.3.3 RT-PCR 檢測(cè) RNA 提取:采用異硫氰酸胍一步法提取子宮組織單個(gè)核細(xì)胞總mRNA，紫外分光光度儀檢測(cè)D260/D280 比值，驗(yàn)證RNA 濃度和純度。RT 反應(yīng):采用oligo dT 為RT 反應(yīng)引物，取2.5 μg 總RNA 按RT 試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 20 μl;PCR 反應(yīng):總反應(yīng)體系為25 μl，包含RT產(chǎn)物5 μl，10 ×PCR buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl22 μl，上、下游引物各0.25 μl(25 pmol/L)，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，Taq DNA 聚合酶0.5 μl，DEPC 水14 μl。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94℃1 min，58℃～60 ℃1 min，72 ℃1 min，26 個(gè)循環(huán)后，70 ℃延長10 min。1.5 %凝膠(EB 染色)水平電泳，采用Alpha 凝膠成像系統(tǒng)分析圖像:以β-actin 為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因與同步β-actin 灰度值比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3.4 治療后子宮出血天數(shù) 記錄URSA 患者從服藥第1 天至子宮出血完全停止的天數(shù)。

1.3.3.5 觀察指標(biāo) (1)Th1(CD4+IFN-γ+)亞群占CD4+細(xì)胞百分比，Th2(IL-4+CD4+)亞群占CD4+細(xì)胞百分比。(2)Th1 亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子T-bet 及Th2 亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s 表示。采用One Way-ANOVA 方差分析，兩組間比較采用Turkey 法檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)間相關(guān)性用Pearson 相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)(r 值)為正，表示正相關(guān)，r 值為負(fù)，表示負(fù)相關(guān)。各組數(shù)據(jù)P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎固沖方對(duì)URSA 患者Th1 亞群比例的影響 流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)外因子檢測(cè)顯示，URSA 患者治療前Th1 亞群比例明顯高于正常妊娠組，提示Th1 亞群比例升高可能在URSA 的發(fā)病中扮演了重要角色。補(bǔ)腎固沖方治療后，URSA 患者Th1 亞群比例明顯降低，與治療前比較有顯著性差異(P ＜0.05)，提示補(bǔ)腎固沖方通過下調(diào)Th1 亞群比例治療URSA，見圖1。

2.2 補(bǔ)腎固沖方對(duì)URSA 患者Th2 亞群比例的影響 流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)外因子檢測(cè)顯示，URSA 患者治療前Th2 亞群比例顯著低于正常妊娠組，提示Th2 亞群比例降低可能是URSA 發(fā)病機(jī)制之一。補(bǔ)腎固沖方治療后，URSA 患者示Th2 亞群比例明顯升高，與治療前比較有顯著性差異(P ＜0.05)，提示上調(diào)Th2 亞群比例可能是補(bǔ)腎固沖方治療URSA 的機(jī)制之一，見圖2。

表1 PCR 引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 RT-PCR primer sequences and products length

圖1 外周血Th1 亞群比例比較Fig.1 Comparison of Th1 proportion in peripheral blood

2.3 補(bǔ)腎固沖方對(duì)Th1/Th2 亞群比率的影響 結(jié)果顯示，URSA 患者Th1/Th2 亞群比率明顯高于正常妊娠組(P ＜0.05)，提示Th1/Th2 亞群偏移是導(dǎo)致URSA 發(fā)病的機(jī)制之一。補(bǔ)腎固沖方治療后，URSA 患者Th1/Th2 亞群比率明顯降低，與治療前比較有顯著性差異(P ＜0.05)，與正常妊娠組比較無明顯差異(P ＞0.05)，提示補(bǔ)腎固沖方能優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)模式向Th2 亞群偏移，逆轉(zhuǎn)URSA 患者Th1/Th2失衡狀態(tài)，進(jìn)而治療URSA。

2.4 治療后子宮出血天數(shù)與Th1、Th2 亞群相關(guān)性分析 補(bǔ)腎固沖方治療后，URSA 患者子宮出血均停止，隨訪均足月分娩。Pearson 相關(guān)性分析顯示，URSA 患者服用補(bǔ)腎固沖方治療后子宮出血停止時(shí)間與Th1、Th2 比例及Th1/Th2 亞群比率呈顯著相關(guān)性，其中子宮出血天數(shù)與Th1 亞群比例呈顯著正相關(guān)(r=0.521，P ＜0.05)，與Th2 亞群比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.213，P ＞0.05)，與Th1/Th2 亞群比率呈正相關(guān)(r=0.560，P ＞0.05)，見圖4。

2.5 補(bǔ)腎固沖方對(duì)URSA 患者T-bet mRNA、GATA-3mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響 RT-PCR 結(jié)果顯示，與正常妊娠組比較，URSA 患者治療前外周血Th1 亞群特異性和轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA 轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(P ＜0.05)，Th2 亞群特異性和轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(P ＜0.05)。補(bǔ)腎固沖方治療后，URSA 患者T-bet mRNA 表達(dá)明顯降低，GATA-3 mRNA 表達(dá)明顯升高，與正常妊娠組比較無明顯差異(P ＞0.05)，提示調(diào)節(jié)Th1、Th2 亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平是補(bǔ)腎固沖方逆轉(zhuǎn)URSA患者Th1/Th2 亞群失衡的機(jī)制之一。

圖2 外周血Th2 亞群比例比較Fig.2 Comparison of Th2 proportion in peripheral blood

圖3 外周血Th1/Th2 亞群比率比較Fig.3 Comparison of ratio of Th1/Th2 cells in peripheral blood

圖4 治療后子宮出血天數(shù)與Th1、Th2、Th1/Th2 亞群相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between uterine bleeding duration and Th1，Th2 and Th1/Th2 subsets

圖5 外周血T-bet、GATA-3 mRNA 表達(dá)比較Fig.5 Expression of T-bet and GATA-3 mRNA in peripheral blood

3 討論

胚胎攜帶父方的MHC 單元型，相對(duì)于母體猶如成功的半同種異體移植，母胎免疫耐受機(jī)制在其中發(fā)揮著重要的作用［6］。T 細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)的主體，初始T 細(xì)胞遇抗原刺激后在特異性核轉(zhuǎn)錄因子與分化誘導(dǎo)因子作用下分化為不同亞群，分泌特征性細(xì)胞因子，主導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)［7］。Th1、Th2 是經(jīng)典的T 細(xì)胞亞群，Th1 細(xì)胞特征性地分泌白介素-2(IL-2)、干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，在母胎免疫排斥中發(fā)揮著重要作用［8］;Th2 細(xì)胞特征性地分泌IL-4、IL-5 和IL-10 等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)體液免疫，在母胎免疫耐受的建立與維持過程中扮演了重要角色［9］。正常妊娠中Th1/Th2 平衡向Th2 亞群漂移，有利于形成與維持正常的母胎免疫耐受狀態(tài)［10］。研究已證實(shí)Th1 型細(xì)胞因子表達(dá)升高及Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)降低與妊娠丟失密切相關(guān)［11］，我們的前期研究亦證實(shí)藥物流產(chǎn)過程中存在Th1/Th2 亞群向Th1 偏移現(xiàn)象［12，13］。本研究結(jié)果顯示URSA 患者Th1 亞群比例明顯高于正常妊娠，Th2 亞群比例明顯低于正常妊娠，Th1/Th2 比率明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)Th1/Th2 亞群失衡參與了URSA 的發(fā)生。

目前，URSA 治療主要采用非特異性免疫抑制劑、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)輸?shù)确椒ǎ嬖诏熜Р环€(wěn)定、副作用大、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)［14］。中醫(yī)藥具有毒副作用小、安全有效的優(yōu)點(diǎn)，因此成為URSA 治療研究的熱點(diǎn)。URSA 屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”范疇，亦稱“數(shù)墮胎”。中醫(yī)認(rèn)為“腎主生殖”，《素問·奇病論》指出:“胞絡(luò)者，系于腎”，《女科經(jīng)綸·引女科集略》說:“女之腎脈系于胎，是母之真氣，子之所賴也，若腎氣虧損，便不能固攝胎元”。腎藏精，為先天之本、天癸之源、沖任氣血之根，是促使與維持女性生殖功能的主導(dǎo)。若先天稟賦不足，腎氣未充，或因孕后房事不節(jié)，縱欲所傷，以致腎氣虧虛，沖任損傷，胎失所系，而致屢孕屢墮。因此，腎虛沖任不固是URSA 的主要病機(jī)，補(bǔ)腎固沖是本病基本治療原則。補(bǔ)腎固沖方根據(jù)補(bǔ)腎固沖安胎原則組方，方中菟絲子、桑寄生補(bǔ)腎固沖，為君藥;阿膠養(yǎng)血止血，陳皮、杜仲健脾補(bǔ)腎，為臣藥;黃芩、白術(shù)清熱安胎，為佐;甘草調(diào)和諸藥，為使;諸藥合用，共奏補(bǔ)腎固沖、養(yǎng)血安胎之功效。

本研究顯示，補(bǔ)腎固沖方治療后，URSA 患者Th1亞群比例顯著降低，Th2 亞群比例顯著升高，提示逆轉(zhuǎn)Th1/Th2 亞群偏移是補(bǔ)腎固沖方治療URSA 的作用靶點(diǎn)之一。相關(guān)性分析顯示，補(bǔ)腎固沖方治療后，子宮出血天數(shù)與Th1 亞群比例呈顯著正相關(guān)，與Th2亞群比例呈負(fù)相關(guān)，與Th1/Th2 亞群比例呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)補(bǔ)腎固沖方通過逆轉(zhuǎn)Th1/Th2 亞群失衡介導(dǎo)母胎免疫耐受，進(jìn)而發(fā)揮治療URSA 的作用。初始T 細(xì)胞受到抗原刺激后，在分化誘導(dǎo)因子及特異性核轉(zhuǎn)錄因子作用下分化為Th1/Th2 亞群，T-bet 和GATA-3 分別是Th1、Th2 亞群的特異性核轉(zhuǎn)錄因子，在其亞群分化過程中發(fā)揮著重要作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎固沖方能顯著下調(diào)URSA 患者Th1 亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子T-bet 轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)上調(diào)Th2 亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2 亞群偏移，逆轉(zhuǎn)URSA 患者Th1/Th2 亞群失衡狀態(tài)，介導(dǎo)母胎免疫耐受。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Th1/Th2 亞群失衡在URSA 發(fā)病中的作用，闡釋了藥物靶向逆轉(zhuǎn)Th1/Th2 亞群失衡治療URSA 的作用與分子機(jī)制，為精確指導(dǎo)臨床治療及創(chuàng)新藥物研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，URSA 發(fā)病過程中T 細(xì)胞亞群失衡的始動(dòng)因素尚未明確，此方面的深入探討將進(jìn)一步闡釋URSA 中T 細(xì)胞亞群失衡的原因及分子機(jī)制，為臨床治療提供更加有效的靶點(diǎn)與途徑。

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