雷帕霉素對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞10 種與細(xì)胞自噬相關(guān)的miRNAs表達(dá)的影響①

張 濤 鄭錫銘 周林林 劉 鑫 趙 瑾 徐廣賢

(寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，銀川 750004)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約21～25 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼單鏈小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中［1］。它主要通過(guò)作用于靶基因的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)抑制靶基因mRNA 的翻譯或使其降解［2］。當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)刺激時(shí)，miRNA 可以通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，從而在多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。其中自噬(Autophagy，ATG)途徑在這一反應(yīng)中起著重要作用，自噬是一種高度保守的生物學(xué)代謝機(jī)制，主要發(fā)揮著細(xì)胞內(nèi)降解和蛋白的循環(huán)利用等功能［3，4］。細(xì)胞自噬對(duì)維持內(nèi)環(huán)境平衡是不可或缺的，因此自噬活性的改變、自噬通路的異常調(diào)節(jié)通常與一些疾病相關(guān)。

miRNA 參與細(xì)胞自噬途徑的調(diào)控，通過(guò)靶向作用于自噬途徑中的相關(guān)基因進(jìn)而影響自噬的水平。已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-101［3］，miR-30a［5］，miR-376b［6］，miR-181a［7］等直接靶標(biāo)STMN1、ATG4D、RAB5A、Beclin1、ATG4C、ATG5、和BNCN1 等自噬基因抑制自噬 的 發(fā) 生;miR-30d (靶 標(biāo) BECN1、BNIP3L、ATG12、ATG5 和ATG2 等)抑制自噬的發(fā)生，對(duì)自噬機(jī)制研究有重要意義［8］;另外研究表明miR-21［10］，miR-212/132［9］、miR-502［11］、miR-130a［12］、miR-199a-5p［13］對(duì)自噬發(fā)生也具有重要作用。這些miRNA 的表達(dá)異常與自噬水平密切相關(guān)，使得miRNA成為因自噬的異常引起的腫瘤、感染、神經(jīng)退行性病變等疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

最近研究表明自噬異?？赡芘c腫瘤、感染、神經(jīng)退行性病變等疾病有關(guān)［14，15］，而自噬的調(diào)控又與miRNA 的表達(dá)水平密切相關(guān)。本研究通過(guò)TargetScan、miRanda 等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)與自噬相關(guān)的特異性miRNA 分子。利用Real-Time PCR 檢測(cè)方法檢測(cè)雷帕霉素對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞中miR-200a、miR-30b 等10 個(gè)miRNA 表達(dá)的影響，而目前關(guān)于這些miRNAs 在雷帕霉素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后的表達(dá)水平以及對(duì)細(xì)胞自噬調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究為進(jìn)一步驗(yàn)證這些miRNAs 在細(xì)胞自噬途徑中的調(diào)控作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑 胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司;雷帕霉素(Rapamyclin)購(gòu)自Sigma 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購(gòu)自Thermo 公司;Small RNA 提取試劑盒(RNAiso for SmallRNA)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;SYBR GreenⅠ試劑盒購(gòu)自TaKaRa;TaKaRa TaqVersion 2.0 購(gòu)自TaKaRa 公司;RAW264.7 細(xì)胞為小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞系(本實(shí)驗(yàn)室保存);DH5α 感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)莖環(huán)法檢測(cè)引物，分別為莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物、RT-PCR 上游與下游引物。Real-Time PCR 通用下游引物:CTCAACTGGTGTCGTGGA;內(nèi)參基因U6 上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA;U6 下游引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT。根據(jù)miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中成熟的miRNA 序列分別設(shè)計(jì)莖環(huán)引物(表1)和特異性檢測(cè)引物(表2)。

1.2 方法

1.2.1 MicroRNA 的生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 利用microRNA.org、Target Scan、miRanda 及PicTar 等生物信息學(xué)軟件查閱文獻(xiàn)確定將miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-142-3p、miR-377 作為研究對(duì)象。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞模型的建立 第一天將小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞復(fù)蘇，向RAW264.7 細(xì)胞加入5 ml 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養(yǎng)液，二者均置于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分到六孔板中，等到細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)，正常組換成含10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組采用50 μg/ml 雷帕霉素的含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.3 Real-Time PCR 檢測(cè)

表1 莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物Tab.1 Primers used for reverse transcription

表2 Real time PCR 上游檢測(cè)引物Tab.2 Forward primers used for qRT-PCR

1.2.3.1 利用莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA 與T 載體的構(gòu)建 采用Small RNA 提取試劑盒從細(xì)胞中提取RNA，根據(jù)thermo 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)說(shuō)明書(shū)，以RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA;利用特異的microRNA 上游引物、通用下游引物各1 μl，模板cDNA 2 μl 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，用3%的瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物回收之后，參照Invitrogen T 載體說(shuō)明書(shū)將目的片段與T 載體連接，測(cè)序鑒定。

1.2.3.2 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線 將miRNA 重組T 載體稀釋到1 ng/μl，進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍比稀釋?zhuān)魅? μl 做模板，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 檢測(cè)miRNAs 的表達(dá)水平 利用Small RNA 提取試劑盒從RAW264.7 細(xì)胞中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用于Real-Time PCR 檢測(cè)，利用羅氏light cycler 實(shí)時(shí)定量PCR 儀，反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex.TaqTM(2×)10 μl，PCR 上游引物(10 μmol/L)0.8 μl，PCR 下游引物(10 μmol/L)0.8 μl，模板2 μl，RNA-free water 補(bǔ)充至20 μl。反應(yīng)程序?yàn)?95℃30 s 1 cycle ;95℃5 s，Tm 30 s，72℃30 s，40 cycle;37℃20 min 1 cycle;實(shí)驗(yàn)設(shè)置2 個(gè)平行復(fù)孔，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7 細(xì)胞中microRNA 的擴(kuò)增 細(xì)胞中提取的Small RNA 經(jīng)莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA 后，PCR 產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳條帶如圖1 所示。測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建T 載體正確;檢測(cè)結(jié)果表明提取的small RNA 質(zhì)量較好，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)Real-Time PCR 實(shí)驗(yàn)。

2.2 熒光定量PCR 結(jié)果

2.2.1 雷帕霉素處理細(xì)胞2 h 后，經(jīng)過(guò)Real-Time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-142-3p是表達(dá)上調(diào)(＞2.5 倍P ＜0.05);而miR-377 則是顯著性表達(dá)下調(diào)(＞50 倍，P ＜0.05)，如圖2 所示。

2.2.2 雷帕霉素處理細(xì)胞4 h 后，經(jīng)過(guò)Real-Time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-17-5p、miR-106a、miR-377 顯著性表達(dá)上調(diào)(＞2 倍，P ＜0.05)，miR-183、miR-200a表達(dá)下調(diào)(＞2.1 倍，P ＜0.05)，如圖3 所示。

2.2.3 雷帕霉素處理細(xì)胞6 h 后，經(jīng)過(guò)Real-Time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-142-3p 是表達(dá)上調(diào)(＞2.8 倍，P ＜0.05)，如圖4 所示。

2.2.4 雷帕霉素處理細(xì)胞8 h 后，經(jīng)過(guò)Real-Time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-142-3p 是表達(dá)上調(diào)(＞2.4 倍，P ＜0.05);而miR-30b、miR-377 則是顯著性低表達(dá)(＞50 倍，P ＜0.05)，如圖5 所示。

圖1 microRNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Results of PCR

圖2 雷帕霉素處理細(xì)胞2 h 后檢測(cè)miRNAs 的表達(dá)Fig.2 Results of expression of miRNAs after cells were treated by rapamycin for 2 hours

圖4 雷帕霉素處理細(xì)胞6 h 后檢測(cè)miRNAs 的表達(dá)Fig.4 Results of expression of miRNAs after cells was treated by rapamycin for 6 hours

圖5 雷帕霉素處理細(xì)胞8 h 后檢測(cè)miRNAs 的表達(dá)Fig.5 Results of expression of miRNAs after cells were treated by rapamycin for 8 hours

3 討論

自噬(Autophagy)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，是生物在發(fā)育、衰老的過(guò)程中存在的一個(gè)消除自身多余或者受損細(xì)胞器以及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的共同機(jī)制［16］。自噬被誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)形成一種稱(chēng)為隔離膜或吞噬泡的小囊泡樣結(jié)構(gòu)，并與需降解的胞漿成分集結(jié)在一起，然后隔離膜延伸并包裹封閉胞漿成分形成一個(gè)雙層膜的結(jié)構(gòu)，即自噬體，自噬體與溶酶體直接融合形成自噬溶酶體，包裹的胞漿成分最終在溶酶體酶的作用下被降解利用［17，18］。在此過(guò)程中，一些自噬相關(guān)基因的表達(dá)，如atg5、atg7、atg8、atg12 等對(duì)自噬的形成至關(guān)重要［19］。雷帕霉素作為細(xì)胞自噬發(fā)生常用的誘導(dǎo)劑之一，通過(guò)抑制mTOR 途徑，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-17-5p 參與調(diào)控細(xì)胞自噬的過(guò)程，并且通過(guò)靶向ATG7 從而抑制細(xì)胞自噬，抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)變［20］。另有研究表明，miR-17 在炎癥通路中也具有重要調(diào)節(jié)作用，miR-17 和miR-106a 通過(guò)靶向作用于信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(signalregulatory protein α，SIRPα)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)［21］。miR-183 敲除后抑制MTC 的增殖，并且影響自噬的水平［22］。本研究結(jié)果表明雷帕霉素作用RAW264.7 巨噬細(xì)胞后，分別于2、4、6 h miR-17-5p、miR-106 表達(dá)上調(diào)(大于2.1 倍P ＜0.05)，miR-214在2、8 h 表達(dá)上調(diào)(大于2.4 倍，P ＜0.05)。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-30b、miR-30c、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-142-3p 在2、6、8 h 表達(dá)上調(diào)(大于2.4 倍，P ＜0.05)，而miR-183、miR-200a 在4 h 表達(dá)下調(diào)(大于2.1 倍，P ＜0.05)，miR-30b 在8 h 則顯著性表達(dá)下調(diào)(大于50 倍，P ＜0.05)。miR-377 在4 h 則是表達(dá)上調(diào)(大于2.5 倍，P ＜0.05)，但在2、8 h 則是顯著表達(dá)下調(diào)(大于50 倍，P ＜0.05)，說(shuō)這些miRNA 可能在不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)細(xì)胞自噬起著正/負(fù)向調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)建立雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞模型，定量檢測(cè)結(jié)果表明雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞后miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-377 發(fā)生顯著性變化。其中miR-17-5p、miR-183 已被證明參與調(diào)控細(xì)胞自噬的過(guò)程［16，17］，而miR-30b、miR-30c、miR-376c、miR-200a、miR-377、miR-142、miR-106a、miR-214 調(diào)控細(xì)胞自噬的機(jī)制目前尚不明確根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)這些miRNA 分子可能通過(guò)靶向某些自噬相關(guān)基因從而促進(jìn)或者抑制自噬的水平。我們將對(duì)其進(jìn)行深入的研究與探討，本實(shí)驗(yàn)為探究miRNA 在調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮的作用而提供理論依據(jù)。

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