芍藥苷對牛Ⅱ型膠原誘導的小鼠關節(jié)炎模型T 細胞作用機制研究①

蔡 力 張 晗 齊淵元 張立麗 黃曉婉 聶 紅

(上海交通大學醫(yī)學院，上海市免疫學研究所，上海 200025)

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節(jié)軟骨病變、滑膜細胞增生為特征的系統(tǒng)性、炎性自身免疫性疾?。?］。RA 的病因和發(fā)病機制尚不明確，目前認為是相關基因、環(huán)境等因素共同作用引起，細胞因子及免疫細胞的調(diào)節(jié)失衡是其病理發(fā)病過程的中心環(huán)節(jié)［2］，其中自身反應性T 細胞在RA 發(fā)病過程中起重要作用［3］。目前RA 藥物治療主要包括非甾體類抗炎藥、抗風濕藥、免疫抑制劑、免疫和生物制劑等，但往往治療效果局限或有嚴重副作用［4］。作為中國瑰寶，傳統(tǒng)中藥如白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)已在臨床使用，并且對RA 具有較好療效。芍藥苷(Paeoniflorin，PF)是白芍總苷的單體提取物，含量超過90%，與白芍總苷相比具有易溶于水、易量化等特點，同時也具有擴張動脈血管、解痙鎮(zhèn)痛、抗炎抗?jié)?、調(diào)節(jié)血糖、免疫調(diào)節(jié)、護肝、抗腫瘤等作用［5］。本研究采用牛Ⅱ型膠原誘導的CIA(Collagen-induced arthritis)小鼠模型，觀察PF 治療CIA 的療效，探討其在自身反應性T 細胞方面的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級DBA/1J 小鼠(雄性，18～20 g，8～10 周)購于上海斯萊克實驗動物有限公司［SCK(滬)2012-0002］，飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院動物科學部屏障環(huán)境內(nèi)，倫理學審核編號:2014039。

1.1.2 主要藥物及試劑 牛Ⅱ型膠原蛋白(Collagen Ⅱ，CII，Chondrex 公司，USA);完全弗氏佐劑(Complete freund’s adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐劑(Incomplete freund’s adjuvant，IFA)(Sigma 公司，USA);冰乙酸(上海試劑四場昆山分廠);芍藥苷(PF，上海一林生物科技有限公司，純度≥95%);Mouse CD4 (L3T4)MicroBeads 和mouse/human CD11b MicroBeads(Miltenyi Biotec 公司，Germany);Anti-mouse CD3 Functional Grade Purified 和Antimouse CD28 Functional Grade Purified(eBioscience，USA);流式熒光抗體Anti-mouse CD4、Anti-mouse IL-17、Anti-mouse IFN-γ、Cell Stimulation Cocktail(plus protein transport inhibitors)(500 ×)(eBioscience，USA);IFN-γ、IL-17 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(R＆D 公司，USA)。

1.2 方法

1.2.1 CIA 模型建立和分組干預 用0.05 mol/L冰乙酸溶解CII 至3 mg/ml，4℃攪拌過夜，次日取CII 與等體積CFA 充分乳化(冰上操作)至油包水狀態(tài)，使膠原濃度為1.5 mg/ml;初次免疫時，于DBA/1J 小鼠尾根部皮下2～3 cm 處注射100 μl 乳化膠原;第21 天，取CII 與等體積IFA 充分乳化(冰上操作)至油包水狀態(tài)，使膠原濃度為1.5 mg/ml，于相同位置注射50 μl 乳化膠原加強免疫。第21 天，模型小鼠隨機分為對照組(Vehicle 組，1 × PBS，即Phosphate Buffered Saline，200 μl/d)和治療組(PF組，7.5 mg/kg·d)，腹腔注射，每組8 只，至第46 天處死，檢測各項指標。

1.2.2 CIA 評分標準 0 分:無紅腫;1 分:局限的足或踝關節(jié)輕度紅腫;2 分:關節(jié)和足趾輕度腫脹;3分:足趾和踝關節(jié)全部腫脹;4 分:踝關節(jié)至全爪紅腫或關節(jié)畸形，每只小鼠四肢評分相加總評分為小鼠關節(jié)炎指數(shù)。

1.2.3 病理學切片 取小鼠膝關節(jié)固定、脫鈣、石蠟包埋，常規(guī)切片做蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察炎性細胞浸潤情況。

1.2.4 淋巴細胞增殖 發(fā)病高峰期處死小鼠，取脾臟，用200 目cell strainer 制備成單個核細胞懸液后接種于96 孔圓底板，每組3 復孔，每孔0.5 ×106個細胞，用CII(40 μg/ml)或anti-CD3/28 Functional Grade Purified(1 μg/ml)刺激。細胞在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，最后16 h 每孔加入0.5 μCi3H-TdR。培養(yǎng)時間到達后，將細胞轉移到玻璃纖維素膜，讀取cpm 值，檢測摻入全脾細胞的3HTdR 量，以評價兩組全脾細胞增殖程度。

CD4 (L3T4)MicroBeads 分選兩組脾臟細胞的CD4+T 細胞，接種于96 孔圓底板，每組3 復孔，每孔0.5 ×106個細胞，anti-CD3/28 Functional Grade Purified(1 μg/ml)刺激，用同上方法檢測摻入CD4+T 細胞的3H-TdR 量，以評價兩組CD4+T 細胞增殖程度。

CD11b MicroBeads 分選Naive 鼠脾臟中的CD11b+細胞，按照1∶3比例分別與對照組和治療組CD4+T 細胞共培養(yǎng)，每組三復孔，每孔共0.5 ×106個細胞，CII(40 μg/ml)刺激，用同上方法檢測摻入細胞的3H-TdR 量，以評價兩組共培養(yǎng)體系中T 細胞增殖程度。

1.2.5 脾臟細胞中Th1/Th17 細胞亞群比例 脾臟細胞接種于96 孔圓底板，每孔0.5 ×106個細胞，加入Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors)(500 ×)后在5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，細胞重懸于100 μl FACS Buffer，首先與FITC-anti-mouse CD4 孵育30 min，F(xiàn)ACS Buffer 洗滌后，按BD 公司Cytofix/Cytoperm Plus kit 說明書破膜固定，與PE-anti-mouse IL-17 和APC-anti-mouse-IFN-γ 孵育30 min，洗滌后加流式緩沖液重懸細胞，F(xiàn)ACS Canto Ⅱ檢測分析。

1.2.6 脾臟細胞培養(yǎng)上清細胞因子含量 各組脾臟細胞接種于96 孔圓底板，每組3 復孔，每孔1.5×106個細胞，用CII(40 μg/ml)刺激。細胞在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，收集培養(yǎng)上清，ELISA 法檢測上清中IFN-γ、IL-17 的含量。

2 結果

2.1 芍藥苷緩解CIA 小鼠臨床癥狀 兩組小鼠在第24 天開始發(fā)病，逐漸出現(xiàn)關節(jié)及足趾腫脹和關節(jié)活動障礙等癥狀，至第45 天到達發(fā)病高峰。與對照組相比，PF 治療組小鼠發(fā)病程度較輕。第39 天開始治療組小鼠臨床評分與對照組比較具有顯著差異(P ＜0.05)，見圖1。由此可見，體內(nèi)給予PF 治療可明顯抑制CIA 發(fā)病程度。

圖1 芍藥苷對CIA 小鼠臨床癥狀的影響Fig.1 Treatment effect of PF on CIA symptoms

2.2 芍藥苷減輕CIA 小鼠關節(jié)炎癥 發(fā)病高峰期處死小鼠，取膝關節(jié)做石蠟切片，HE 染色，觀察關節(jié)炎性細胞浸潤。光鏡下可見:與對照組相比，治療組炎性細胞浸潤明顯減少(圖2)。

2.3 芍藥苷抑制CIA 小鼠脾臟CD4+T 細胞增殖 用3H-TdR 摻入法檢測兩組小鼠CD3/28 抗體刺激的脾臟單個核細胞和CII 特異性單個核細胞增殖情況，結果顯示芍藥苷明顯抑制脾臟單個核細胞和CII特異性單個核細胞增殖。進一步用3H-TdR 摻入法檢測兩組小鼠CD3/28 抗體刺激的CD4+T 細胞和CII 特異性CD4+T 細胞增殖情況，結果顯示芍藥苷明顯抑制CD3/28 抗體刺激的CD4+T 細胞和CII 特異性CD4+T 細胞增殖(圖3)。相比于CD3/28 抗體刺激，PF 組CII 特異性脾臟單個核細胞增殖和CII 特異性CD4+T 細胞增殖抑制更為明顯，提示PF可通過抑制脾臟CII 特異性CD4+T 細胞的增殖，緩解CIA。

圖2 芍藥苷對CIA 小鼠膝關節(jié)組織病理學影響(×200)Fig.2 Histopathology of knee joints from PBS and PFtreated CIA mice by H＆E staining (×200)

圖3 芍藥苷對CIA 小鼠脾臟細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of PF on proliferation of splenocytes from CIA mice

2.4 芍藥苷降低CIA 小鼠Th1 和Th17 細胞亞群比例 CD4+T 細胞在不同細胞因子作用下分別分化為Th1、Th2、Th17、Treg 等細胞亞群，其中Th1 和Th17 細胞在RA 發(fā)病過程中起重要作用［6］。用流式細胞技術檢測兩組小鼠脾臟CD4+T 細胞中Th1和Th17 細胞亞群比例。結果顯示，治療組小鼠Th1和Th17 細胞亞群比例都明顯低于對照組(圖4)，提示芍藥苷可能通過降低Th1 和Th17 細胞亞群比例緩解CIA 臨床癥狀。

圖4 芍藥苷對CIA 小鼠Th1 和Th17 亞群比例的影響Fig.4 Effect of PF on Th1 and Th17 subsets in spleens from CIA mice

圖5 芍藥苷對CIA 小鼠脾臟細胞培養(yǎng)上清中炎性細胞因子的影響Fig.5 Effect of PF on cytokine secretion of splenocytes from CIA mice

2.5 芍藥苷減少CIA 小鼠脾臟細胞培養(yǎng)上清中炎性細胞因子分泌 ELISA 法檢測CIA 小鼠脾臟細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IL-17 和IFN-γ 的表達水平。結果顯示:與對照組相比，治療組脾臟細胞培養(yǎng)上清中IL-17 和IFN-γ 含量顯著降低(圖5)，提示PF 通過減少CII 特異性脾臟細胞分泌炎性細胞因子從而緩解CIA 癥狀。

3 討論

RA 是一種以關節(jié)病變?yōu)樘卣鞯南到y(tǒng)性、炎性自身免疫性疾病，其主要病理表現(xiàn)是:滑膜細胞過度增生、微血管新生和血管翳形成，分泌炎性細胞因子、核因子κB 受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)和抗瓜氨酸蛋白抗體(Antibodies to citrullinated proteins，ACPA)，造成滑膜、軟骨和骨組織的破壞，最終導致關節(jié)畸形影響功能［7］。CIA 是由Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑(CFA)免疫基因易感型小鼠建立的RA 模型，它與RA 有相似的病理學特征:滑膜纖維細胞增生;單核細胞浸潤，軟骨降解;體內(nèi)可以檢測到高滴度的Ⅱ型膠原抗體;炎癥后期骨破壞，并導致不可逆的關節(jié)畸變［8］。由于大多數(shù)RA 病人外周血單個核細胞中都伴有CD4+T 細胞活化［9］，提示以CD4+T 細胞為靶點治療能控制CIA 炎癥反應。

TGP 在臨床上已用于治療風濕免疫性疾病，其治療RA 的主要作用機制包括:止疼鎮(zhèn)靜、抗炎抑炎、抑制滑膜增生和血管翳形成、保護關節(jié)［5］。作為TGP 中的主要單體活性成分，PF 因其易溶于水、吸收好、易于劑量標準化等特點，具有潛在開發(fā)價值［10］。目前已有文獻證實灌胃給予PF 及其相關藥物劑型具有緩解大鼠關節(jié)炎的作用［11］，但其在細胞因子及免疫細胞調(diào)節(jié)方面的作用尚無研究。

本研究表明體內(nèi)注射芍藥苷后CIA 小鼠臨床癥狀明顯緩解。進一步檢測CIA 小鼠脾臟細胞和CD4+T 細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)治療組小鼠脾臟CII 特異性CD4+T 細胞增殖明顯降低，提示芍藥苷能直接抑制CD4+T 細胞增殖。已有文獻證實，CD4 缺陷性小鼠CIA 發(fā)病率更低［12］，同樣提示CD4+T 細胞在CIA 發(fā)病過程中的重要性?；罨腃D4+T 細胞可以分化為不同細胞亞群，其中Th1 和Th17 在CIA病理過程中發(fā)揮重要作用。與大多數(shù)MHCⅡ基因易感性自身免疫性疾病一樣，CIA 小鼠CII 特異性的CD4+T 細胞中Th1 和Th17 細胞亞群比例增高［6，13］。而本研究結果顯示，芍藥苷治療后CIA 小鼠脾臟細胞中Th1 和Th17 細胞比例明顯降低，提示芍藥苷可能通過抑制致病性Th1 和Th17 細胞亞群緩解CIA 病情。IFN-γ 是Th1 細胞分泌的特征性細胞因子，目前根據(jù)環(huán)境不同其在CIA 病理過程中起著雙向作用，現(xiàn)認為在疾病起始階段體內(nèi)細胞因子表達較低時，IFN-γ 起致炎作用，但在疾病晚期，當細胞因子表達達到飽和狀態(tài)時，IFN-γ 起抑炎作用［14］。IL-17 是Th17 分泌的特征性促炎細胞因子，它可以通過激活T 細胞、巨噬細胞介導RA 病理反應［15］，在CII 特異性T 細胞反應起始階段和CII 特異性抗體分泌階段扮演重要角色［16］。已有文獻證實，IL-17 基因敲除小鼠建立CIA 模型，其發(fā)病明顯減輕［17］，說明在CIA 病理過程中IL-17 發(fā)揮重要作用。芍藥苷治療后發(fā)病高峰期CIA 小鼠脾臟細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ 和IL-17 分泌含量降低，提示其可通過減少炎性細胞因子分泌而緩解CIA。

綜上所述，目前研究結果提示芍藥苷可以通過作用于CD4+T 細胞，降低炎性T 細胞亞群比例和減少炎性細胞因子分泌而緩解CIA 病情。這為芍藥苷的藥物開發(fā)提供了實驗依據(jù)，也為進一步機制研究奠定實驗基礎。

［1］Cordova KN，Willis VC，Haskins K，et al.A citrullinated fibrinogen-specific T cell line enhances autoimmune arthritis in a mouse model of rheumatoid arthritis［J］.J Immunol，2013，190(4):1457-1465.

［2］Klareskog L，Catrina AI，Paget S.Rheumatoid arthritis［J］.Lancet，2009，373(9664):659-672.

［3］Gol-Ara M，Jadidi-Niaragh F，Sadria R，et al.The role of different subsets of regulatory T cells in immunopathogenesis of rheumatoid arthritis［J］.Arthritis，2012，2012:805875.

［4］Long JW，Wang YY，Pi XM，et al.Clinical observation on the treatment of chronic urticaria with total glucosides of paeony capsule combined with citirizine［J］.Chin J Integr Med，2010，16(4):353-356.

［5］Zhang W，Dai SM.Mechanisms involved in the therapeutic effects of Paeonia lactiflora Pallas in rheumatoid arthritis［J］.Int Immunopharmacol，2012，14(1):27-31.

［6］Li S，Niu X，Xi Y，et al.T cell vaccination inhibits Th1/Th17/Tfh frequencies and production of autoantibodies in collagen-induced arthritis［J］.Clin Dev Immunol，2013，2013:967301.

［7］Schett G，Gravallese E.Bone erosion in rheumatoid arthritis:mechanisms，diagnosis and treatment［J］.Nat Rev Rheumatol，2012，8(11):656-664.

［8］Hirose J，Tanaka S.Animal models for bone and joint disease.CIA，CAIA model［J］.Clin Calcium，2011，21 (2):253-259.

［9］Kosmaczewska A，Ciszak L，Swierkot J，et al.Alterations in both the activatory and inhibitory potential of peripheral blood CD4+T cells in rheumatoid arthritis patients correlate with disease progression［J］.Pathol Oncol Res，2013，20:235-243.

［10］He DY，Dai SM.Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of paeonia lactiflora pall.，a traditional chinese herbal medicine［J］.Front Pharmacol，2011，2:10.

［11］Wu D，Chen J，Zhu H，et al.UPLC-PDA determination of paeoniflorin in rat plasma following the oral administration of Radix Paeoniae Alba and its effects on rats with collagen-induced arthritis［J］.Exp Ther Med，2014，7(1):209-217.

［12］Ehinger M，Vestberg M，Johansson AC，et al.Influence of CD4 or CD8 deficiency on collagen-induced arthritis［J］.Immunology，2001，103(3):291-300.

［13］Brand DD，Kang AH，Rosloniec EF.Immunopathogenesis of collagen arthritis［J］.Springer Semin Immunopathol，2003，25(1):3-18.

［14］Schurgers E，Billiau A，Matthys P.Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis:focus on interferon-gamma［J］.J Interferon Cytokine Res，2011，31(12):917-926.

［15］Azizi G，Jadidi-Niaragh F，Mirshafiey A.Th17 Cells in Immunopathogenesis and treatment of rheumatoid arthritis［J］.Int J Rheum Dis，2013，16(3):243-253.

［16］Pollinger B.IL-17 producing T cells in mouse models of multiple sclerosis and rheumatoid arthritis［J］.J Mol Med (Berl)，2012，90(6):613-624.

［17］Nakae S，Nambu A，Sudo K，et al.Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL-17-deficient mice［J］.J Immunol，2003，171(11):6173-6177.