基于不同載體制備黃芪甲苷人工抗原的研究①

徐加兵 于生蘭 歐陽臻 洪偉鳴 (江蘇大學藥學院，鎮(zhèn)江212013)

黃芪(Radix Astragali)是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是中醫(yī)補氣的要藥。由于其多種有益機體的功效，現(xiàn)已有不少黃芪制成的藥品及功能食品投放市場。黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ，簡稱AST)是中藥黃芪藥理活性的主要物質之一，為黃芪及其制劑質量鑒定的重要指標［1］。目前常用的黃芪甲苷檢測方法或者操作步驟較為復雜，靈敏度低，或者分析成本高，耗時長［2］。免疫檢測作為一種篩選檢測技術，具有高靈敏度和操作方便等優(yōu)點，而獲得特異性強、靈敏度高的抗體是建立一種準確可行的免疫檢測方法的關鍵。AST 分子量小，是典型的半抗原，需結合一個合適的載體蛋白分子后才具有免疫原性［1］。相關文獻表明不同的載體蛋白對人工抗原免疫小鼠后產生的抗體的靈敏度和特異性有較大影響。因此要獲得特異性強，靈敏度高的抗體，選擇一種合適的蛋白作為合成人工抗原的載體是一項必不可少的研究。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和匙孔型血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)是兩種常用的蛋白載體［3］。本研究利用BSA 和KLH 兩種載體蛋白合成黃芪甲苷人工抗原，通過比較免疫小鼠抗血清的特異性，對兩種不同載體免疫原的免疫原性進行比較。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 AST 標準品(含量98%，HPLC)，成都曼思特生物科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗式完全佐劑(FCA)、弗式不完全佐劑(FICA)，Sigma 公司;羊抗鼠酶標抗體、TMB 單組份顯色劑，美國Pierce 公司;甲醇、NaIO4均為分析純。全自動多功能酶標儀、自動洗板，美國布魯克·道爾頓有限公司;MALDITOF/TOF 質譜儀(Applied Biosystem，4800 普通型)。

1.2 動物 BALB/c 小鼠，雌性，6 只，SPF 級，6 周齡，體重16～18 g，揚州大學實驗動物中心提供。

1.3 人工抗原的合成 溶液配制:將AST 溶于80%甲醇中配成濃度約為3 mg/ml 的溶液取1.7 ml。稱取2.6 mg NaIO4溶于0.5 ml 蒸餾水中。AST氧化:用0.1 ml 注射器將AST 溶液緩緩滴加至NaIO4溶液中，室溫反應4 h。除去多余高碘酸鈉:慢慢往上述反應液中滴加乙二醇4 ml 室溫反應2 h，以終止反應除去過量的NaIO4防止蛋白載體變性。與蛋白偶聯(lián):稱取5 mg BSA 溶于1 ml 碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)中，將經(jīng)NaIO4氧化后的AST 溶液緩緩滴加到BSA 溶液中。封閉避光反應6 h，移至透析袋中，先用PBS 透析，再逐漸降低PBS 濃度至最后以蒸餾水透析，透析72 h。AST-KLH、ASTOVA 的合成方法同上［4］。

1.4 人工抗原的鑒定

1.4.1 紫外全波長掃描法鑒定AST-BSA、ASTKLH、AST-OVA 將半抗原AST、載體蛋白(BSA、KLH、OVA)以及人工抗原，配制成一定濃度的溶液，在200～400 nm 波長下進行紫外掃描，比較人工抗原紫外吸收曲線與游離半抗原、載體蛋白差異［2，4］。

1.4.2 飛行時間質譜法鑒定AST-BSA 偶聯(lián)比 經(jīng)ZipTip C4 脫鹽處理后取1 μl 蛋白樣品點至樣品靶位上，自然干燥后，再取0.6 μl SA 基質溶液點至對應的靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點標準品。在正離子模式下選擇線性方法對樣品測試范圍進行校準測試然后對樣品AST-BSA的分子量進行測定。根據(jù)分子量測定結果，計算偶聯(lián)比。偶聯(lián)比=(MrAST-BSA-MrBSA)/MrAST。

1.4.3 紫外吸收法測定AST-KLH 的偶聯(lián)比 由于KLH 的相對分子量較大，不能通過時間飛行質譜檢測AST-KLH 的偶聯(lián)比，故采用在紫外吸收法測定AST-KLH 的偶聯(lián)比，方法如下:先用甲醇精確配制不同濃度的AST 和KLH 標準溶液，然后將AST-KLH 稀釋到適當濃度后用紫外分光光度計測出AST、ASTKLH 在最大吸收波長處的吸光值，在此基礎上分別測定偶聯(lián)物中AST 和載體蛋白的偶聯(lián)比，采用Lowry法計算出偶聯(lián)物中蛋白質含量。半抗原與蛋白質結合比的計算公式為:偶聯(lián)比=(AST 質量濃度/AST 相對分子質量)/(載體蛋白的質量濃度/載體蛋白的相對分子質量)［5］。

1.5 動物免疫及抗體血清檢測 選擇15 只小鼠，隨機分成三組，每組5 只，標記為組一、組二、組三。組一5 只小鼠以AST-KLH 免疫，組二中5 只小鼠以AST-BSA 免疫，組三中5 只小鼠以生理鹽水混合佐劑注射作為空白對照。免疫方法如下:首次免疫，取一定蛋白濃度的免疫抗原(AST-BSA、AST-KLH)加入等體積弗氏完全佐劑，乳化完全，對小鼠進行皮下多點注射免疫。每只小鼠每次注射100 μl，含100 μg的免疫原(按蛋白含量計算)。2 周后，第一次加強免疫(方法同首免);2 周后，第二次加強免疫(將首免的弗氏完全佐劑換為弗氏不完全佐劑，其余同首免);1 周后眶窩靜脈叢采血，將所采得的血液于37℃水浴放置2 h 后，于4 000 r/min 離心10 min，取上清液備用［6］。分別用AST-OVA、ASTKLH 作包被抗原，間接酶聯(lián)免疫吸附法(indirect enzyme-linked immunosorbent assay，iELISA)檢測ASTBSA 免疫小鼠抗血清抗體效價，AST-KLH 免疫鼠抗血清分別采用AST-OVA 和AST-BSA 作包被抗原檢測。采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)對多抗血清與AST 進行抑制試驗［7］，在進行icELISA 時同樣使用除免疫抗原外的兩種不同人工抗原包被。

2 結果

2.1 黃芪甲苷人工抗原的鑒定 黃芪甲苷、載體蛋白和人工抗原的紫外吸收曲線見圖1。AST、BSA 出峰值的對應波長分別為200 nm 和230 nm 左右。AST-BSA 峰左移，對應波長在210 nm 左右，證明偶聯(lián)成功。同樣KLH 出峰值的波長為280 nm 左右。AST-KLH 峰左移，對應波長為215 nm 左右，證明偶聯(lián)成功。

圖1 抗原紫外全波長掃描圖Fig.1 Identification of antigen by ultraviolet wavelength scanning

圖2 AST-BSA 飛行時間質譜鑒定圖Fig.2 Identification of AST-BSA and BSA by MALDI TOF MS

2.2 偶聯(lián)比的確定 BSA 標準品及AST-BSA 偶聯(lián)物的飛行時間質譜圖見圖2。按照公式:偶聯(lián)比=(MAST-BSA-MBSA)/MAST，計算的偶聯(lián)物AST-BSA 的偶聯(lián)比為13∶1。分別測定AST 和AST-KLH 的吸光度，其中AST 的A210=0.8，KLH 的A280=1.2，ASTKLH 的A280=1.5，按文獻［5］的計算公式ASTKLH 的偶聯(lián)率為15，符合文獻［8］推薦的理想范圍8～25.1內。

2.3 抗體滴度測定 測定之前采用棋盤方陣法測定最佳抗原包被濃度約為4 μg/ml，分別以ASTKLH、AST-OVA 包被酶標板，采用倍比稀釋法檢測AST-BSA 免疫的小鼠的多抗血清效價，結果如圖3所示。由圖可知，兩種人工抗原免疫小鼠所得的血清抗體效價均在1∶512 00 以上，AST-BSA 免疫的小鼠血清抗體效價略高，表明本實驗所制備的兩種人工抗原均能刺激小鼠產生抗體。

2.4 抗體特異性鑒定 以4 μg/ml AST-OVA 作為包被抗原包被酶標板，以AST 為競爭抑制劑進行間接競爭抑制ELISA 實驗，結果圖4 所示。從圖中可知，AST-BSA 免疫的小鼠的多抗血清特異性較差;AST-KLH 免疫的小鼠的多抗血清特異性較強，IC50 最小劑量可達5μg/ml，可見AST-KLH免疫的小鼠的多抗血清具有很好的特異性。

圖3 兩種人工抗原免疫的小鼠血清效價檢測Fig.3 Titer of serum of mice immunized by two artificial antigens

圖4 抗體異性檢測結果Fig.4 Detection of specificity of antibodies

3 討論

本實驗以BSA、KLH 兩種不同蛋白為載體成功合成了黃芪甲苷(AST)的人工抗原，抗原偶聯(lián)比均在文獻推薦范圍內，保證了合成抗原免疫原性強，能產生針對AST 的抗體［8］。用兩種人工抗原免疫小鼠，結果均獲得了效價較高的多抗血清。其中ASTKLH 免疫的小鼠血清效價較之AST-BSA 免疫的小鼠略低，分析原因可能是BSA 是哺乳動物的血清白蛋白，而KLH 是無脊椎動物的血藍蛋白，相比而言BSA 與哺乳動物小鼠的親緣性要強，蛋白本身產生的免疫性要弱，故產生的抗體多是針對AST 的抗體;而KLH 與小鼠親緣性較弱蛋白本身的免疫原性要強，產生的抗體有一部分是針對KLH 的。但是用AST-KLH 免疫的小鼠產生的抗體的特異性較之AST-BSA 免疫小鼠所獲得的抗體血清要強，導致這種差異的可能原因如下:第一，理論上KLH 上有更多的抗原結合位點，AST-KLH 刺激機體產生免疫反應時，AST 的暴露面與機體接觸的幾率更大［9］。第二，AST-BSA 乳化注射小鼠會經(jīng)歷一個蛋白結構外翻并再于體內復性的過程，復性后的蛋白可能和天然蛋白的結構不盡相同，而KLH 不存在這個過程，故產生的抗體具有更強的特異性［10，11］。本試驗根據(jù)AST 有多個鄰羥基結構存在的結構特點，選用高碘酸鈉法合成抗原，結果證明合成是成功的，方法是可行的。通過比較不同人工抗原免疫小鼠所產生的抗體性質可以看出，KLH 作為蛋白載體合成的人工抗原所產生的抗體特異性更強并且抗體的特異性和人工抗原的蛋白載體有較大聯(lián)系。因此選擇一種合適的載體蛋白是制備人工抗原的先決步驟。同時本實驗成功制備了對AST 特異性較強的抗血清，為進一步研究和建立黃芪甲苷的免疫學檢測方法奠定了基礎。

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