嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)銀鯽的免疫效果研究①

毛會(huì)麗 關(guān)建義 賀文旭 康 靜 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

細(xì)菌性敗血病是近幾年來(lái)淡水魚類新出現(xiàn)而且危害非常嚴(yán)重的疾病，其特點(diǎn)是發(fā)病魚種類多，流行范圍廣，發(fā)病后死亡率高，往往給淡水魚養(yǎng)殖業(yè)造成慘重的經(jīng)濟(jì)損失。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是本病的病原菌，感染范圍十分廣泛，不僅可以引起各種淡水魚類嗜水氣單胞菌敗血癥的發(fā)生，還可引起兩棲類、軟體類、爬行類、陸生類、家禽類患病，甚至引起人類軟組織損傷感染、腹瀉及食物中毒等，對(duì)該病的控制，目前主要以抗生素和化學(xué)藥物為主，但引起該病的菌株對(duì)抗生素具有一定的耐藥性，使用化學(xué)藥物會(huì)造成殘留等不良后果，所以研制取代二者的疫苗勢(shì)在必行［1，2］。嗜水氣單胞菌疫苗及其相關(guān)技術(shù)在近幾十年的研究與推廣應(yīng)用中，取得了一系列的可喜成績(jī)［3，4］。嗜水氣單胞菌是異源的，不同菌株間生理生化性狀、血清型、基因型等存在差異，疫苗的保護(hù)效果也存在較大的差異。疫苗的種類隨著時(shí)間的推移，也趨向于多樣化，伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，出現(xiàn)了諸如DNA 疫苗、合成肽疫苗等新型魚用疫苗［5，6］。

本研究采用本地區(qū)自然患細(xì)菌性敗血癥的病例，從中分離鑒定出強(qiáng)毒株，制成滅活菌苗，以注射和浸泡兩種方式進(jìn)行免疫接種，通過(guò)血清抗體效價(jià)、白細(xì)胞吞噬活性、LSZ、T-NOS、SOD、ACP 血清酶活性檢測(cè)，檢測(cè)嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)銀鯽的細(xì)菌性出血病的保護(hù)作用，從而為防治魚類細(xì)菌性出血病提供依據(jù)，也為進(jìn)一步制備其口服及基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 疫苗由本實(shí)驗(yàn)室制備，其制備方法為將疫苗菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯28℃搖床培養(yǎng)16 h后，10 000 r/min 離心20 min，收集菌體，加入磷酸緩沖液(PBS)至菌濃為1 ×108cfu/ml，然后加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，28℃搖床培養(yǎng)24 h，制得嗜水氣單胞菌的滅活疫苗。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)XDMG(1)從新鄉(xiāng)地區(qū)患細(xì)菌性敗血癥的病魚體內(nèi)分離鑒定獲得。該菌株已于2013 年11 月15 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCC No.M2013566。金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)菌株，由本實(shí)驗(yàn)室提供，用于吞噬菌體。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 銀鯽購(gòu)自河南衛(wèi)輝市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，選取健康銀鯽100 尾，每尾質(zhì)量(30±2)g 左右，規(guī)格為體長(zhǎng)14 cm 左右，試驗(yàn)前水族箱中馴養(yǎng)1 周，養(yǎng)殖用水為曝氣后的自來(lái)水，水溫在(28±1)℃左右，試驗(yàn)期間水族箱保持充氣，每天投餌2 次，早晚各1 次，換水時(shí)間為投餌后3 h，日換水量為40%。證實(shí)無(wú)病后用于試驗(yàn)。

1.3 主要儀器及試劑 Eclipse E200 顯微鏡(日本Nikon 公司)，Leica 冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司)，DNM-9606 型酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)，溶菌酶(LSZ)、總一氧化氮合酶(T-NOS)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、酸性磷酸酶(ACP)活力測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 方法

1.4.1 銀鯽免疫接種試驗(yàn) 選取30 g 的健康銀鯽90 尾隨機(jī)分為3 組，分別為注射免疫、浸泡免疫和對(duì)照組。第1 組為腹腔注射組，注射劑量為0.2 ml/尾，初免后28 d 進(jìn)行二次免疫;第2 組為浸泡免疫［9］，7 d 后用同等方法加強(qiáng)免疫一次;第3 組為對(duì)照組，于6.5 mg/ml 的生理鹽水中浸泡30 min。二次免疫后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，觀察并記錄各組動(dòng)物7 d內(nèi)的臨床癥狀及死亡情況，解剖死亡魚并分離致病菌，判斷是否由攻毒菌感染致死，并統(tǒng)計(jì)各組的死亡率，免疫保護(hù)率(RPS)=［1 -(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)］×100%;然后取各組銀鯽的肝臟、腎臟、脾臟、大腸制作冰凍切片，常規(guī)HE 染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察;同時(shí)在加強(qiáng)免疫后0、1、2 和3 周在3 組中隨機(jī)取5 尾銀鯽尾靜脈取血，血液分成2 份，1 份加入肝素抗凝，用于白細(xì)胞吞噬活性試驗(yàn);1 份置4℃條件下24 h，3 000 r/min 離心10 min，收集血清用于血清凝集效價(jià)檢測(cè)和ACP、LSZ、T-NOS 和T-SOD 血清酶活性的測(cè)定。

1.4.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 在加強(qiáng)免疫21 d 后，每組隨機(jī)挑取30 尾魚，以50LD50嗜水氣單胞菌攻擊，同樣采取腹腔注射的方式，同樣環(huán)境下培養(yǎng)10 d，每天觀察并記錄各組死亡數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算魚的免疫保護(hù)率。

1.4.3 血清抗體效價(jià)的檢測(cè) 采用96 孔V 型血凝板按照常規(guī)方法進(jìn)行。

1.4.4 銀鯽白細(xì)胞吞噬活性試驗(yàn) 0.2 ml 抗凝血加入0.2 ml 的金黃色葡萄球菌菌液，搖勻，25℃水浴60 min，水浴期間每隔10 min 搖動(dòng)1 次，用吸管吸取混合液涂片，每個(gè)樣涂5 片，用甲醇固定3～5 min，Giemsa 染色30～60 min，水洗風(fēng)干后油鏡觀察。吞噬百分比(PP)=100 個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100×100%;吞噬指數(shù)(PI)=吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)/被計(jì)數(shù)參與吞噬的細(xì)胞數(shù)。

1.4.5 血清酶活力的測(cè)定 用試劑盒測(cè)定血清中溶菌酶(LSZ)、總一氧化氮合酶(T-NOS)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和酸性磷酸酶(ACP)的活性，具體測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.0 和Excel 分析軟件進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)各組之間的差異顯著性采用兩組間獨(dú)立樣本雙尾t 檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫保護(hù)率及病理切片 通過(guò)注射和浸泡免疫的銀鯽經(jīng)2 次免疫7 d 后進(jìn)行攻毒，注射組和浸泡組銀鯽保護(hù)率分別達(dá)到90%和60%，對(duì)照組銀鯽全部死亡，見(jiàn)表1。

病理組織切片表明對(duì)照組的銀鯽表現(xiàn)為急性敗血癥癥狀，肝臟出現(xiàn)廣泛的組織細(xì)胞變性、溶解、壞死;紅細(xì)胞腫大、破裂、溶解，毛細(xì)血管、小細(xì)血管管壁的破損;內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性，嚴(yán)重溶血等，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹、變性、壞死和解體等(圖1C);腎臟的腎小體壞死，腎小球囊腔變大，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、壞死、崩解，腎小管管腔縮小，多數(shù)呈蛋白管型(圖1F);脾臟的脾紅髓與白髓難以辨認(rèn)，小體結(jié)構(gòu)不清晰，組織細(xì)胞大量溶解、壞死，血源性色素沉積最為顯著(圖1I);腸道的腸絨毛壞死、脫落，腸絨毛上皮細(xì)胞壞死、脫落等(圖1L)。而注射組、浸泡組的組織病理切片未表現(xiàn)出典型的急性敗血癥癥狀，特別是注射組的肝臟、腎臟、脾臟和大腸組織基本無(wú)損傷(圖1A、D、G、J)，而浸泡組表現(xiàn)出輕微的損傷(圖1B、E、H、K)。

表1 免疫保護(hù)率Tab.1 Relative percent survival of all groups challenged by Aeromonas hydrophila

圖1 嗜水氣單胞菌攻毒三組48 h 后的肝、腎、脾、大腸病理HE 染色(×100)Fig.1 Liver，kidneys，spleen，intestine pathological changes characteristic infected by Aeromonas hydrophila(×100)

2.2 凝集抗體效價(jià) 表2 為加強(qiáng)免疫21 d 后，3 組血清中凝集抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果。注射組、浸泡組的銀鯽血清中凝集抗體效價(jià)均較高，而對(duì)照組銀鯽血清凝集抗體效價(jià)很低。注射組、浸泡組和對(duì)照組銀鯽血清中的凝集抗體效價(jià)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，而注射組和浸泡組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 白細(xì)胞吞噬活性 白細(xì)胞吞噬活性見(jiàn)表3，注射組和浸泡組銀鯽血液中白細(xì)胞的PP 和PI 呈逐漸上升趨勢(shì)，接種14 d 顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)，在21 d 時(shí)達(dá)到峰值(P ＜0.01)，隨后逐漸下降，但接種35 d 時(shí)仍維持較高水平。在整個(gè)試驗(yàn)期間注射組和浸泡組的PP 和PI 值均高于對(duì)照組。

2.4 血清酶活性的測(cè)定

2.4.1 溶菌酶 由圖2 可知，在銀鯽免疫后0 周，經(jīng)注射免疫和浸泡免疫銀鯽血清中的溶菌酶含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，均與對(duì)照組差異顯著，且注射組與其他兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表2 三組血清凝集抗體效價(jià)Tab.2 Serum agglutination titers of injected groups，soaked groups and control groups

表3 血液中白細(xì)胞吞噬活性Tab.3 Phagocytic activity and bactericidal index of blood leucocytes

圖2 嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)銀鯽血清LSZ 活性的影響Fig.2 Effect on alkaline phosphatase (LSZ)of carassius gibelio challenged by Aeromona hydrophila inactivated vaccine

圖3 嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)銀鯽血清T-NOS 活性的影響Fig.3 Effect on alkaline phosphatase (T-NOS)of carassius gibelio challenged by Aeromona hydrophila inactivated vaccine

圖4 血清T-SOD 活性變化Fig.4 Effect on alkaline phosphatase (T-SOD)of carassius gibelio challenged by Aeromona hydrophila inactivated vaccine

圖5 嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)銀鯽血清ACP 活性的影響Fig.5 Effect on alkaline phosphatase (ACP)of carassius gibelio challenged by Aeromona hydrophila inactivated vaccine

2.4.2 總一氧化碳合酶 由圖3 可知，在銀鯽免疫后第3 周，注射組的血清NOS 活性極顯著高于對(duì)照組和浸泡組(P ＜0.05)，在免疫后其他采樣點(diǎn)，3 個(gè)處理組之間血清NOS 活性無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。

2.4.3 總超氧化物酶 由圖4 可知，在銀鯽免疫后第0 周，注射組和浸泡組的血清中T-SOD 活性均顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)，而兩組之間差異不顯著(P ＞0.05)。在免疫后第2、3 周，3 組之間T-SOD活性差異均不顯著(P ＞0.05)。

2.4.4 酸性磷酸酶 由圖5 可知，在銀鯽免疫后第2 周，注射組的血清ACP 活性顯著高于對(duì)照組和浸泡組(P ＜0.05)，在免疫后第3 周，注射組的血清ACP 活性極顯著高于對(duì)照組、浸泡組(P ＜0.01)，在其他采樣時(shí)間點(diǎn)，3 組之間血清ACP 活性差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討論

關(guān)于淡水魚類對(duì)于滅活疫苗的免疫應(yīng)答，已有許多研究者做過(guò)相關(guān)研究，其結(jié)果大多證實(shí)了受免魚能對(duì)所接種的疫苗產(chǎn)生不同水平的免疫應(yīng)答［7-10］。如孫寶劍等［8］將嗜水氣單胞菌滅活疫苗用注射和浸泡的方式免疫鱖魚，發(fā)現(xiàn)浸泡組特異性抗體出現(xiàn)較早，推測(cè)其存在著獨(dú)立的抗體產(chǎn)生系統(tǒng)。Esteve 等［9］將抗弧菌的二聯(lián)疫苗用4 種途徑免疫鰻鱺，發(fā)現(xiàn)浸泡免疫可誘導(dǎo)血清和皮膚黏膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且腸道產(chǎn)生抗體峰值在時(shí)間上與皮膚黏液相同，但持續(xù)時(shí)間短、效價(jià)低。孫金輝等［10］將嗜水氣單胞菌滅活疫苗采用腹腔注射的方式免疫虹鱒，發(fā)現(xiàn)注射免疫能顯著提高白細(xì)胞吞噬率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)、LZM 活力和補(bǔ)體C3 含量。本試驗(yàn)將分離鑒定過(guò)的嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株制備成滅活菌苗，然后通過(guò)兩種不同的途徑免疫銀鯽，結(jié)果證明了注射組和浸泡組的白細(xì)胞吞噬活性、LSZ、ATP、SOD、NOS 血清酶的活性均顯著高于對(duì)照組，而注射組各項(xiàng)指標(biāo)又優(yōu)于浸泡組，這些指標(biāo)均證明銀鯽體內(nèi)存在較高的抗體水平，疫苗起到了較好的保護(hù)作用。

以注射和浸泡兩種方式進(jìn)行免疫接種，其保護(hù)率分別為90%、60%。通過(guò)白細(xì)胞吞噬活性、ATP、SOD、PO、LSZ 血清酶活性檢測(cè)，其免疫組各項(xiàng)指標(biāo)均高于對(duì)照組，病理切片結(jié)果表明免疫過(guò)的動(dòng)物器官如肝、脾、腎及大腸未出現(xiàn)明顯的病理改變，而未免疫動(dòng)物發(fā)生明顯病變，說(shuō)明該疫苗安全有效，為進(jìn)一步制備其口服及基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3.1 滅活疫苗對(duì)銀鯽感染嗜水氣單胞菌后的保護(hù)作用 攻毒試驗(yàn)表明，三組銀鯽感染嗜水氣單胞菌后表現(xiàn)出不同的病理表現(xiàn)，這與付亞成等［8］的報(bào)道是一致的。注射組和浸泡組相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，較遲出現(xiàn)死亡，死亡率明顯低于對(duì)照組，且未出現(xiàn)典型的出血癥狀，證明了用甲醛滅活的疫苗經(jīng)注射免疫和浸泡免疫可在一定程度上降低嗜水氣單胞菌的危害。以前也有類似的研究報(bào)道［5，6］，大多數(shù)魚類特異性抗體的產(chǎn)生需要長(zhǎng)期的適應(yīng)并通過(guò)產(chǎn)生免疫記憶而形成［11-13］，而本試驗(yàn)中銀鯽的相對(duì)免疫保護(hù)率在短時(shí)間內(nèi)的提高，可能與注射免疫和浸泡免疫提高了魚體內(nèi)的非特異性免疫力有關(guān)［14，15］。而浸泡免疫組的相對(duì)保護(hù)率略低于注射免疫組，表明浸泡免疫效果不佳，具體原因還有待于進(jìn)一步的研究。

3.2 滅活疫苗對(duì)銀鯽感染嗜水氣單胞菌后的血清非特異性免疫指標(biāo)的影響 溶菌酶是淡水魚類非特異性免疫系統(tǒng)的重要成分之一，在魚體抵抗感染性致病菌的最前沿防御機(jī)制中起著重要作用。在魚體內(nèi)，溶菌酶主要存在于血液、肌肉和淋巴組織中，代表一定非特異性免疫水平的溶菌酶活性，在魚體內(nèi)比在哺乳動(dòng)物體內(nèi)更為重要，因?yàn)轸~類的特異性免疫系統(tǒng)還不完善。國(guó)外關(guān)于魚類溶菌酶已有較深入的研究，如選擇含溶菌酶較多的虹鱒作為溶菌酶基因供體，向溶菌酶含量較少的種類(如大西洋娃魚和鱔魚)的魚卵中注射溶菌酶基因，從遺傳上改善這些魚類的免疫狀況。國(guó)內(nèi)有關(guān)淡水魚類溶菌酶的研究，也有專門報(bào)道［10］。因此，本試驗(yàn)就銀鯽血清溶菌酶活性作一初步觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)注射免疫和浸泡免疫銀鯽血清中的溶菌酶含量均先增加后降低的趨勢(shì)，均與對(duì)照組差異顯著，且注射組與其他兩組差異顯著(P ＜0.05)。說(shuō)明注射和浸泡免疫可提高銀鯽溶菌酶活性，從而達(dá)到提高銀鯽抗病能力的目的。這與聶品等［15］得出的結(jié)論非特異性免疫在感染初期對(duì)魚體起主要保護(hù)作用是一致的。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)抗氧化酶系中主要成員之一，其主要作用是能專一地清除體內(nèi)過(guò)多的超氧陰離子自由基［16］。SOD 的活性變化在一定程度上可反映出機(jī)體在脅迫逆境下的免疫力［17］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)免疫組的SOD 活性均高于對(duì)照組，SOD 活性在免疫前期的升高可能與魚體遭到嗜水氣單胞菌侵襲后，激活了該誘導(dǎo)酶的活性有關(guān)［18］，后期的下降則可能與魚體因病原菌感染而導(dǎo)致活性氧自由基的水平超過(guò)了自身的清除閾值有關(guān)，SOD 活性受到抑制?？傄谎趸己厦?T-NOS)活性的變化是機(jī)體對(duì)外源異物的一種免疫應(yīng)答反應(yīng)，在一定程度上能夠反映生物機(jī)體的健康狀況和抗病力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射免疫和浸泡免疫能顯著提高銀鯽血清中NOS活性，由此表明通過(guò)提高NOS 活性，從而提高了銀鯽的免疫應(yīng)答反應(yīng)。有研究表明堿性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)均是無(wú)脊椎動(dòng)物吞噬溶酶體酶的重要組成部分，ALP 和ACP 直接參與磷酸基團(tuán)的代謝與轉(zhuǎn)移，并與DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等代謝有關(guān)，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)注射和浸泡免疫后的銀鯽，血清ALP 和ACP 活性顯著提高。

總之，在銀鯽的體液免疫中，溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)、總一氧化碳合酶(T-NOS)、堿性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)發(fā)揮著重要作用，能以不同的途徑消滅異物，并抵御病原體的侵襲，通過(guò)注射免疫和浸泡免疫能顯著提高以上各種血清酶活性，提高其免疫應(yīng)答能力。雖然注射免疫效果優(yōu)于浸泡免疫，但在實(shí)際應(yīng)用中，浸泡免疫省時(shí)省力、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，因此在生產(chǎn)應(yīng)用中，浸泡不失為一種優(yōu)先考慮的給藥途徑;與高等脊椎動(dòng)物相比較，魚類的免疫應(yīng)答能力較低，因此免疫效果較小鼠略差，所以在疫苗的使用過(guò)程中要加強(qiáng)免疫或者加入佐劑等，以提高機(jī)體的免疫原性［18］。本試驗(yàn)證明了該方案制備的疫苗可以有效地抵抗嗜水氣單胞菌所導(dǎo)致的腹水癥，對(duì)于病原菌的入侵能夠產(chǎn)生明顯的防御作用，對(duì)該疫苗起到了較好的防治腹水癥和敗血癥的作用，在疾病的高發(fā)期對(duì)未患病的幼魚提前使用可達(dá)到有效地預(yù)防作用。

［1］Delamare A P，Echeverrigaray S，Duarte K R，et al，Production of a Monclonal Antibody Against Aeromonas hydrophila and Its Application to Bacterial Identification［J］.J Appl Microbiol，2002，92(5):936-940.

［2］陳 瑞，于 輝，唐 旭，等.抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體的制備及初步鑒定［J］.免疫學(xué)雜志，2007，23(5):583-585.

［3］張玉芬，張秀軍，亢喜剛.鯉魚細(xì)菌性敗血癥的病原菌鑒定及疫苗研制［J］.醫(yī)學(xué)動(dòng)物防治，2011，27(1):44-46.

［4］蔣啟歡，葉應(yīng)旺，胡 王，等.草魚嗜水氣單胞菌L1 滅活疫苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.生物技術(shù)進(jìn)展，2012，2(3):206-211.

［5］王秀華，周凌云，王玉娟，等.多效價(jià)載體疫苗免疫大菱鮮效果［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2011，18(4):918-923.

［6］劉雨果，潘厚軍，石存斌，等.3 種免疫途徑對(duì)嗜水氣單胞菌滅活疫苗保護(hù)作用的影響［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31(4):81-85.

［7］Vivas J，Riano J，Carracedo B，et al.The auxotrophic aroA mutant of Aeromonas hydrophila as a live attenuated vaccine against A.salmonicida infections in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)［J］.Fish Shellfish Immunol，2004，16(2):193-206.

［8］孫寶劍，張永安，聶 品.鱖皮膚粘液和腮粘液中特異性抗體產(chǎn)生規(guī)律的初步研究［J］.魚類病害研究，2001，23(3):73-77.

［9］Esteve MD，F(xiàn)ouz B，Amaro C.Efficacy of a bivalent vaccine against eel diseases caused by Vibrio vulnificus after its administration by four different routes ［J］.Fish Shellfish Immunol，2004，16:93-105.

［10］孫金輝，王慶奎，陳成勛，等.嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)虹鱒免疫力和抗病力的影響［J］.淡水漁業(yè)，2013，43(1):44-49.

［11］Ming J H，Xie J，Xu P，et al.Molecular cloning and expression of two HSP70 genes in the Wuchang bream (Megalobrama amblycephala Yih)［J］.Fish Shellfish Immunol，2010，28:407-418.

［12］Park J H，Lee J J，Yoon S，et al .Genomic cloning of the Hsc71 gene in the hermaphroditic teleost Rivulus marmoratus and analysis of its expression in skeletal muscle :identification of a novel muscle-preferred regulatory element［J］.Nucl Acids Res，2001，29(14):3041-3050.

［13］Anderson DP.Immunostimulants and vaccine carrier in fish :application to aquaculture［J］.Annu Rev Fish Dis，1992，2:281-307.

［14］Navarre O，Halver J E.Disease resistance and humoral antibody production in rainbow trout fed high levels of vitaminC［J］.Aquaculture，1989，79:223-224.

［15］聶 品.魚類非特異性免疫研究的新進(jìn)展［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1997，21(1):69-73.

［16］張 明，王 雷，郭振宇，等.脂多糖和弧菌對(duì)中國(guó)對(duì)蝦血清磷酸酶、超氧化物歧化酶和血藍(lán)蛋白的影響［J］.海洋科學(xué)，2004，28(7):22-25.

［17］Anderson DP.Adjuvants and immunostimulants for enhancing vaccine potency in fish［J］.Dev Biol Stand，1997，90:257-265.

［18］Parihar MS，Dubey AK，Javeri T，et al.Changes in lipid peroxidation，superoxide dismutase activity，ascorbic acid and phospholipid content in liver of freshwater catfish Heteropneustes fossilis exposed to elevated temperature［J］.J Therm Biol，1996，21(5-6):323-330.