脂多糖誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞parkin 表達及線粒體自噬形成①

程艷偉 靳夢醒 閆 海 黃大可 黃保軍 張林杰

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，合肥 230032)

革蘭陰性菌感染機體后，巨噬細胞通過其表面膜受體，在其他輔助蛋白的共同作用下識別革蘭陰性菌細胞壁成分脂多糖(LPS)，引起一系列炎癥因子的釋放，誘發(fā)多種炎癥反應(yīng)，以限制清除病原菌。然而過度的炎癥反應(yīng)則會造成機體嚴重傷害［1，2］。

目前認為重度炎癥發(fā)生時伴隨多種組織細胞的線粒體損傷及功能障礙。PRAK2 基因最早在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)現(xiàn)，其表達產(chǎn)物parkin 是一種E3 泛素蛋白連接酶，在泛素蛋白酶體系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。parkin 能選擇性的聚集在損傷線粒體上，通過誘導(dǎo)線粒體自噬而清除損傷線粒體［3］。在多巴胺神經(jīng)元和HEK293 等細胞中，parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬對維持細胞的正常功能和細胞生存發(fā)揮重要作用［4］。但在巨噬細胞對LPS 刺激的應(yīng)激反應(yīng)中，parkin 及其介導(dǎo)的線粒體自噬是否參與對損傷線粒體的清除，目前尚不清楚。本研究擬通過建立小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)毒素應(yīng)激模型，觀察巨噬細胞在內(nèi)毒素刺激后parkin 表達分布及線粒體自噬發(fā)生情況，為進一步完善炎癥反應(yīng)調(diào)控的可能途徑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種小鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供;LPS 購自美國Sigma 公司;RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司;胎牛血清購自美國Hyclone 公司;TRIzol 試劑和Mitotracker Green 染料購自美國Invitrogen 公司;mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega 公司;PCR Mix 購自美國MBI Fermentas公司;parkin 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司;LC3 單克隆抗體購自美國CST 公司;β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司;Alexa Fluor 647 標記山羊抗兔IgG (H+L)和Cy3 標記山羊抗小鼠IgG(H +L)購自上海碧云天公司;特異性引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離和原代培養(yǎng) 取20～25 g 昆明小鼠，頸椎脫臼處死，無菌分離小鼠腹腔細胞。將混合細胞懸液放入培養(yǎng)箱中，靜置2 h，讓巨噬細胞貼壁。清除懸浮細胞后，得到腹腔巨噬細胞，然后再加入含10%胎牛血清、1%雙抗的1640完全培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至少4 h 后，再給細胞以相應(yīng)處理。

1.2.2 JC-1 法檢測線粒體膜電位 將巨噬細胞接種于6 孔板中，每孔加入200 ng/ml LPS 分別作用0、3、6、12、18 h 和24 h，輕輕刮掉細胞，連同上清液一起1 500 r/min，離心10 min，獲得細胞。依據(jù)JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明，按懸浮細胞方法處理，于流式細胞分析儀上檢測線粒體膜電位情況。

1.2.3 RT-PCR 檢測小鼠腹腔巨噬細胞parkin mRNA 的表達水平 收集培養(yǎng)皿中200 ng/ml LPS 處理0、3、6、12、18 h 和24 h 后細胞，用TRIZOL 法提取各組巨噬細胞總RNA。先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再將cDNA 用PCR Mix(2 ×)進行PCR 擴增。GAPDH 引物序列:上游引物5'-CAG TGG CAA AGT GGA GAT TGT TG-3'，下游引物5'-CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA T-3';parkin上游引物5'-CCA CGA TGC TCA ACT TGG CTA C-3'，下游引物5'-CAC GTC AAA CCA GTG ATC TCC C-3'。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳，儀器拍照并用相應(yīng)分析軟件測得各目的條帶光密度值(OD)，與內(nèi)參GAPDH 進行比較，計算OD 比值，分析各時間點目的基因的表達情況。

1.2.4 Western blot 檢測parkin、LC3 I 和II 的表達變化 同前收集各組細胞，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，再4℃，14 000 r/min 離心30 min，取上清，此為細胞總蛋白。BCA 法蛋白定量后加入上樣緩沖液后煮沸5 min。各取30 μg 總蛋白經(jīng)SDSPAGE 電泳，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后用5%脫脂奶粉/TBST 室溫下封閉2 h，分別用β-actin 抗體(1∶1 000)、parkin 抗體(1∶500)和LC3 抗體(1∶1 000)4℃搖床過夜孵育(12～24 h)。TBST 洗10 min×3 次，再對應(yīng)加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)室溫孵育1～2 h，TBST 洗10 min ×5次。用ECL 試劑盒進行顯影曝光。采用凝膠分析軟件測得各蛋白條帶光密度值(OD)，并與內(nèi)參βactin 進行比較，計算出OD 比值，分析各組各時間點目的蛋白表達情況。

1.2.5 細胞免疫熒光法檢測parkin 在巨噬細胞中分布 將小鼠腹腔巨噬細胞加入預(yù)先放有無菌蓋玻片的24 孔板中，去除懸浮細胞培養(yǎng)4 h，制備細胞爬片。加入200 ng/ml LPS 作用6 h，取出細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 洗3 ×5 min，0.3% Triton X-100 室溫作用10 min 進行細胞膜通透，PBS 清洗，10%小牛血清37℃封閉1 h，1∶100 稀釋的parkin 抗體4℃冰箱孵育24 h，PBS 洗3 ×5 min，F(xiàn)ITC 標記的山羊抗小鼠二抗37℃避光孵育1 h，PBS 洗5 ×5 min，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 細胞免疫熒光法檢測parkin、LC3 和線粒體三者共定位 同前述方法制備細胞爬片，處理細胞。孵育一抗時，同時加入parkin 抗體(1∶100 稀釋)和LC3 抗體(1∶100 稀釋)，4℃冰箱孵育24 h，PBS 洗3 ×5 min，再同時加入parkin 二抗(Cy3 標記山羊抗小鼠IgG，1∶100 稀釋)和LC3 二抗(Alexa Fluor 647標記山羊抗兔IgG，1∶100 稀釋)，37℃避光孵育1 h，PBS 洗5 × 5 min，最后用MitoTracker Green(100 nmol/L)標記線粒體，室溫30 min，PBS 洗5 ×5 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用IBM SPSS Statistics 19 統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析。實驗數(shù)據(jù)采用±s 表示，各時間點間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞經(jīng)LPS 刺激后，線粒體膜電位呈下降趨勢 JC-1 是線粒體的一種特異性染料，在線粒體膜電位正常時為聚合物(J-aggregates)，呈橘紅色，若線粒體發(fā)生損傷，膜電位下降后，JC-1 則變成單體(monomer)，呈綠色，流式細胞儀檢測線粒體紅光和綠光比例可檢測線粒體損傷情況。巨噬細胞在經(jīng)LPS(200 ng/ml)刺激0、3、6、12、18 h 和24 h 后，流式細胞儀檢測結(jié)果如圖1 所示:巨噬細胞線粒體膜電位隨LPS 作用時間延長呈持續(xù)下降趨勢，膜電位下降的線粒體與正常線粒體的比例由刺激前的4.02%±0.18%增加到刺激24 h 后的25.43%±0.37%，表明巨噬細胞經(jīng)LPS 刺激后存在線粒體損傷，且隨作用時間延長損傷加劇。

2.2 parkin 在巨噬細胞經(jīng)LPS 刺激前后的表達變化 為了解parkin 在巨噬細胞中的表達情況，應(yīng)用200 ng/ml LPS 分別作用小鼠腹腔巨噬細胞0、6、12 h 和24 h，通過RT-PCR 和Western blot 分別檢測parkinmRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示:巨噬細胞在LPS 刺激后，parkin 在蛋白水平表達明顯增多，至刺激后12 h 達到最高峰(圖2);parkin mRNA 表達水平增加不明顯(結(jié)果未顯示)。

圖1 LPS(200 ng/ml)作用巨噬細胞后線粒體膜電位變化情況Fig.1 Changes in mitochondrial membrane potential of murine peritoneal macrophages induced by LPS(200 ng/ml)

2.3 LPS 刺激前后，parkin 在巨噬細胞內(nèi)的定位情況 小鼠腹腔巨噬細胞在200 ng/ml LPS 刺激6 h后，利用細胞免疫熒光法標記parkin，DAPI 染細胞核，通過激光共聚焦顯微鏡檢測parkin 在巨噬細胞中的分布情況。結(jié)果顯示:巨噬細胞在未受刺激狀態(tài)下，parkin 均勻分布在細胞質(zhì)中，在LPS 刺激后parkin 形成聚集體，呈斑點狀聚集分布在細胞中(圖3)。

2.4 小鼠腹腔巨噬細胞在LPS 刺激后LC3 的表達水平 自噬體形成時，胞漿LC3 的羧基端會被酶解掉一小段多肽產(chǎn)生LC3 Ⅰ，LC3 Ⅰ羧基端的甘氨酸與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合產(chǎn)生LC3 Ⅱ，被招募并定位在自噬體膜的內(nèi)外表面。通過Western blot 檢測LC3 Ⅱ的蛋白水平以及LC3 Ⅱ和LC3 Ⅰ比值大小可評估自噬發(fā)生的程度。用200 ng/ml LPS 分別作用小鼠腹腔巨噬細胞0、6、12 h 和24 h，Western blot檢測LC3 Ⅰ和Ⅱ的表達水平，結(jié)果顯示:在LPS 刺激后，巨噬細胞LC3 Ⅱ的表達隨刺激時間延長逐漸增多，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值也增大，表明LPS 導(dǎo)致巨噬細胞發(fā)生自噬(圖4)。

圖2 LPS(200 ng/ml)作用小鼠腹腔巨噬細胞后parkin表達水平Fig.2 Expression of parkin protein in murine peritoneal macrophages induced by LPS (200 ng/ml)

圖3 parkin 在巨噬細胞中的分布情況Fig.3 Distribution of parkin in murine peritoneal macrophages

圖4 LPS(200 ng/ml)作用小鼠腹腔巨噬細胞后LC3 Ⅱ與LC3 Ⅰ蛋白比例變化情況Fig.4 Expressions of LC3 Ⅱand LC3 Ⅰprotein in murine peritoneal macrophages induced by LPS (200 ng/ml)

圖5 Parkin、線粒體和自噬體三者在細胞中存在共定位情況，LPS(200 ng/ml)作用巨噬細胞6 hFig.5 Co-localization of parkin，mitochondria and LC3 in murine peritoneal macrophages when stimulated with LPS(200 ng/ml)after 6 h

2.5 LPS 刺激后，巨噬細胞內(nèi)parkin、LC3 和線粒體存在共定位關(guān)系 LPS 刺激巨噬細胞后，存在線粒體損傷、細胞自噬，同時parkin 由均勻分布轉(zhuǎn)成向明顯的斑點狀聚集。為探討三者之間可能存在的相互作用，在200 ng/ml LPS 作用巨噬細胞6 h 后，分別用三種不同熒光染料標記parkin、線粒體和LC3，通過激光共聚焦顯微鏡檢測三者的共定位情況，結(jié)果顯示:LPS 刺激后，巨噬細胞內(nèi)parkin、線粒體和LC3存在共定位，表明parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬形成(圖5)。

3 討論

病原微生物入侵機體后，巨噬細胞借助其表面模式識別受體、Fc 受體和補體受體等首當其沖對病原微生物做出快速反應(yīng)，是參與固有免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)細胞。巨噬細胞通過分泌多種酶類、細胞因子和反應(yīng)性氧中間物等參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。巨噬細胞釋放的多種生物活性物質(zhì)可以限制病原體的侵害，但過度的炎癥反應(yīng)也可造成機體損傷。

線粒體在調(diào)控細胞凋亡、能量代謝方面起著重要作用，在機體受到病原微生物感染時，由于缺血、缺氧和過度炎癥應(yīng)答常導(dǎo)致多種組織細胞線粒體功能改變及線粒體膜電位的降低［5］。線粒體膜電位降低可促進mtROS 產(chǎn)生及線粒體DNA 釋放到胞質(zhì)，從而誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體的活化［6，7］。同時，NLRP3 炎癥體活化又促進mtDNA 的釋放，致使線粒體進一步損傷。受損線粒體需要及時清除，以保證細胞正常生命活動的進行［8］。線粒體自噬就是將多余或損傷線粒體與溶酶體結(jié)合進行自噬選擇性清除的過程［9］。

本研究首先應(yīng)用脂多糖作用于小鼠腹腔巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)脂多糖可導(dǎo)致巨噬細胞線粒體膜電位降低，表明線粒體在巨噬細胞對內(nèi)毒素應(yīng)答中起到一定作用，這與Arnoult 等［10］研究結(jié)果相一致。巨噬細胞在對內(nèi)毒素應(yīng)答中會導(dǎo)致線粒體損傷，如不能及時清除損傷線粒體，可能會進一步加重炎癥反應(yīng)。Parkin 及其介導(dǎo)的線粒體自噬在對損傷或多余線粒體的選擇性清除過程中發(fā)揮重要作用［11］。Narendra等［3］研究顯示，HEK293 和Hela 細胞在加入CCCP引起線粒體損傷后，parkin 能夠被選擇性募集至線粒體膜電位降低的線粒體，而使胞質(zhì)中parkin 降解減少，parkin 在細胞中表達相對增多，并通過E3 泛素連接酶活性介導(dǎo)這些損傷的線粒體經(jīng)自噬體途徑清除，以減少對細胞的損傷。本研究利用RT-PCR和Western blot 的方法檢測了parkin 在小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)毒素應(yīng)激中的表達變化，結(jié)果顯示parkin在mRNA 水平變化不明顯，但在蛋白水平表達明顯增多，表明parkin 在胞質(zhì)中降解減少，提示parkin 可能通過蛋白水平的變化發(fā)揮相應(yīng)的作用。對parkin在巨噬細胞受到脂多糖刺激前后分布的研究表明，巨噬細胞在未受刺激狀態(tài)下parkin 在胞質(zhì)中均勻分布，而脂多糖刺激后則轉(zhuǎn)變成明顯的點狀聚集;同時對自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ及LC3 Ⅰ表達變化的檢測發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在受到LPS 刺激后發(fā)生明顯的自噬，與張梅等［12］在巨噬細胞系RAW264.7 中的研究結(jié)果一致。進一步對parkin、LC3 及線粒體共定位分析的結(jié)果顯示，parkin 參與了巨噬細胞對清除損傷線粒體的線粒體自噬發(fā)生，表明其可能在巨噬細胞參與的炎癥反應(yīng)中起到一定的調(diào)控作用。

本研究深入探討了小鼠腹腔巨噬細胞在內(nèi)毒素刺激下parkin 的表達變化及其介導(dǎo)的線粒體自噬形成，提示parkin 可能通過介導(dǎo)線粒體自噬方式參與巨噬細胞對內(nèi)毒素應(yīng)激所致炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。為進一步明確parkin 在巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的作用及機制，更深入的實驗可通過基因轉(zhuǎn)染及RNA 干擾技術(shù)調(diào)控parkin 的表達，并觀察其對內(nèi)毒素誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥因子釋放的影響，為完善炎癥反應(yīng)調(diào)控的可能途徑提供新的思路。

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