響應面法優(yōu)化纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基

響應面法優(yōu)化纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基

龔國利 王娜 劉麗麗
（陜西科技大學 生命科學與工程學院，西安 710021）

以纖維堆囊菌SOF5-76為試驗菌株，用響應面分析法對其產(chǎn)埃博霉素B的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以提高埃博霉素B的產(chǎn)量。在單因素試驗的基礎上，利用Plackett-Burman篩選出對埃博霉素B產(chǎn)量有顯著影響的3個因素為馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉和無水氯化鈣，在此基礎上通過最陡爬坡試驗逼近最佳響應面區(qū)域；再運用Box-Behnken試驗設計和響應面分析法進行回歸分析，確定重要因素的最優(yōu)濃度。得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：馬鈴薯淀粉3.9 g/L、脫脂奶粉2.2 g/L、無水氯化鈣1.3 g/L、葡萄糖1 g/L，豆餅粉1.5 g/L，七水硫酸鎂2.5 g/L，EDTA-Fe3+3 mL/L，微量元素（TE）0.5 mL/L，VB121 mL/L。在此最優(yōu)條件下發(fā)酵埃博霉素B的產(chǎn)量為29.95 mg/L，與模型預測值接近，發(fā)酵產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了1.1倍。

埃博霉素B 纖維堆囊菌 發(fā)酵培養(yǎng)基 響應面法優(yōu)化

埃博霉素（Epothilones）是黏細菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類次級代謝產(chǎn)物［1］，是一種新型的抗腫瘤藥物。其作用機制與紫杉醇相同，通過促微管聚合作用從而抑制腫瘤細胞的增殖［2］，并且與紫杉醇相比，埃博霉素具有毒性更小、水溶性更好［3］、對紫杉醇耐藥性細胞作用更強、抗腫瘤譜更廣等優(yōu)點，因此埃博霉素被譽為最具有潛力的抗腫瘤新藥之一［4-6］。

目前有很多種化學法可以合成埃博霉素B，但是反應條件苛刻，成本高，合成路線長，產(chǎn)率低，污染環(huán)境，而發(fā)酵法則可以克服上述缺點。為了實現(xiàn)埃博霉素的大規(guī)模生產(chǎn)，生物發(fā)酵是理想的途徑。但是目前該法產(chǎn)量低，不穩(wěn)定，受培養(yǎng)條件和環(huán)境等因素的影響較大，所以在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，主要通過菌種選育和優(yōu)化發(fā)酵工藝條件來提高埃博霉素的產(chǎn)量。

本研究以纖維堆囊菌SOF5-76為試驗菌株，該菌株是由本實驗室從土壤中篩選，經(jīng)基因重組技術(shù)選育獲得的遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株之一，經(jīng)過為期1年的觀察，此菌株產(chǎn)量較其他菌株（SoF5-09）穩(wěn)定，埃博霉素產(chǎn)量不穩(wěn)定是其研究的一大難題。雖然實驗室前期已采用正交法研究了另一高產(chǎn)菌株SoF5-09的發(fā)酵工藝［7，8］，分別對埃博霉素B的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，使埃博霉素產(chǎn)量分別達到27.5 mg/L、33.5 mg/L。由于菌株的特異性，且試驗菌株穩(wěn)定性較好，因此對其發(fā)酵合成埃博霉素B的營養(yǎng)條件進行優(yōu)化具有一定的意義。諸景光等［6］曾采用響應面法對埃博霉素發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，篩選出的重要因素皆為培養(yǎng)條件相關(guān)的因素，不能實現(xiàn)對營養(yǎng)條件系統(tǒng)優(yōu)化的目的。本研究則著重考慮營養(yǎng)條件對埃博霉素產(chǎn)量的影響，對其進行系統(tǒng)的優(yōu)化。目前，統(tǒng)計學試驗設計已經(jīng)成功應用于一些培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化［9-13］，本研究采用統(tǒng)計學試驗設計對纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行系統(tǒng)的優(yōu)化，旨在提高埃博霉素B產(chǎn)量，且為其規(guī)?；a(chǎn)奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 纖維堆囊菌SoF5-76（Sorangium cellulosumSoF5-76）由本實驗室從土壤中篩選，經(jīng)過基因組重組技術(shù)選育獲得，埃博霉素B產(chǎn)量為14.2 mg/L［14］。

1.1.2 培養(yǎng)基 CNST培養(yǎng)基：KNO30.05%，Na2HPO40.025%，MgSO47H2O 0.1%，F(xiàn)eCl30.001%，瓊脂 2%，微量元素液 1 mL/L，pH7.2。1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min。

M26培養(yǎng)基：土豆淀粉8.0 g/L，大豆蛋白胨2.0 g/L，葡萄糖2.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl21.0 g/L，EDTA-Fe3+1 mL/L，微量元素1 mL/L，以KOH調(diào)節(jié)pH值為 7.2。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精0.3%，蔗糖0.07%，葡萄糖0.02%，豆餅粉0.17%，七水硫酸鎂0.17%，無水氯化鈣0.3%，EDTA-Fe3+2 mL/L，微量元素（TE）0.5 mL/L，pH7.2，樹脂XAD-16 2%。1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min［13］。

1.1.3 試劑 EPothilone B標準品購于Singma公司；XAD-16樹脂購于德國Sigma公司；馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉、豆餅粉為食品級，市場購買，其余試劑均為分析純。

1.1.4 儀器 Waters-2487-2420-1525高效液相色譜

儀，美國waters公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)：將保藏在固體斜面培養(yǎng)基的菌種接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中在30℃條件下培養(yǎng)5-7 d后，轉(zhuǎn)接于 M26培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，在30℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后，得到作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：以5%（V/V）接種量將所得種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵體系為300 mL三角瓶裝液量為50 mL，在30℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d。

1.2.2 埃博霉素B提取及含量測定 埃博霉素B提取：發(fā)酵結(jié)束后，過濾收集樹脂，用10倍體積甲醇振蕩浸提24 h后，棄去樹脂，甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干，再加入500 μL甲醇復溶，轉(zhuǎn)移到離心管中。

埃博霉素B檢測：采用HPLC定量分析。液相色譜條件：色譜柱：YWG，C18，10 μm，250×4.6 mm；Waters-2487高效液相色譜儀；UV紫外檢測器；檢測波長：249 nm，流動相：甲醇∶水=65∶35（體積比）；上樣體積：20 μL，時間：30 min，流速：1 mL/min。埃博霉素B的定量采用本實驗室用的標準曲線。方程為：y=0.132x+0.0035。

采用HPLC檢測埃博霉素B所得的峰面積，根據(jù)標準曲線換算成埃博霉素B產(chǎn)量。

1.2.3 Plackett-Burman設計 Plackett-Burman設計用來確定對埃博霉素B產(chǎn)量有顯著影響作用的因子以及去除一些可有可無的因子。每個因子設置高低兩個水平，分別用“+”、“-“表示，設定高水平為低水平的2倍。根據(jù)前期單因子試驗的結(jié)果，影響埃博霉素B產(chǎn)量的因素有單因子試驗初步確定的最佳碳源（馬鈴薯淀粉、葡萄糖）、氮源（豆餅粉、脫脂奶粉、乙酸銨）、生長因子VB12、無機鹽（七水

硫酸鎂、無水氯化鈣）鐵離子（EDTA-Fe3+）。 選用N=12的Plackett-Burman設計，考察上述9個因素對埃博霉素B產(chǎn)量影響的重要性。

1.2.4 最陡爬坡試驗 由于響應面擬合多項式模型只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，所以應先使得顯著因素的水平盡量逼近最佳區(qū)域再建立有效的擬合方程，最陡爬坡試驗可以實現(xiàn)。根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，對篩選出的顯著因素的變化方向、步長作了相應的設計。

1.2.5 Box-Behnken試驗 逼近最大響應區(qū)域后，應用Box-Behnken設計對顯著因子進行優(yōu)化，尋找菌種發(fā)酵使得EpoB產(chǎn)量達到最大的最優(yōu)條件。根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，確定顯著因子的高、中、低水平，表征為1、0、-1，使用SAS9.2軟件試驗設計及響應面分析。

2 結(jié)果

2.1 Plackett-Burman設計篩選重要影響因素

自變量編碼和水平因素見表1，Plackett-Burman試驗設計結(jié)果見表2。使用SAS9.2軟件對試驗結(jié)果進行回歸分析得到了回歸方程以及各影響因子的顯著性（表3）。由表3可知，馬鈴薯淀粉（A）、脫脂奶粉（D）和無水氯化鈣（G）為影響埃博霉素B產(chǎn)量的顯著因素，除了確定這3個重要影響因子之外，還據(jù)此對初始發(fā)酵培養(yǎng)基做出相應的改變和調(diào)整，氮源中由于乙酸銨對埃博霉素B 產(chǎn)量的影響甚小，故在后續(xù)試驗發(fā)酵培養(yǎng)基去掉這一成分，其余不顯著的變量的取值結(jié)合效應的正負和節(jié)約正本的原則，進行調(diào)整。

表1 Plackett-Burman試驗設計水平及編碼

表2 Plackett-Burman試驗設計結(jié)果及響應值

表3 Plackett-Burman試驗中各因素的效應分析

2.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗分析的結(jié)果，結(jié)合試驗的實際需要，在最陡爬坡試驗中對埃博霉素B產(chǎn)量影響顯著的因素的變化方向、步長作了相應的設計，具體取值和試驗結(jié)果見表4。由表4可知，埃博霉素B產(chǎn)量的變化趨勢是先上升后下降，其中從中心點開始到3Δ之間都顯著增加，在0+3Δ水平上達到最大值，3Δ以后埃博霉素B產(chǎn)量開始下降，

由此判斷出最佳發(fā)酵條件在0+3Δ水平附近，故以0+3Δ水平為后續(xù)試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗設計與結(jié)果

2.3 Box-Behnken試驗設計及響應面分析

2.3.1 二次回歸模型擬合及方差分析 以馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉和氯化鈣3個重要因素為自變量，以埃博霉素B產(chǎn)量為響應值。各因素編碼水平見表5，試驗設計及結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken試驗因素水平及編碼

表6 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果

根據(jù)表6中試驗結(jié)果，利用SAS軟件對結(jié)果進行二次回歸分析，獲得的回歸方程為：

Y=29.78+1.88125X1-1.085X2+0.21125X3-1.6 0 6 2 5 X1X1-1.3 0 5 X1X2-0.8 6 7 5 X1X3-1.63375X2X2+0.59X2X3-0.79625X3X3

對該模型進行方差分析，結(jié)果見表7，模型系數(shù)顯著性檢驗見表8。

從表7中可以看出模型在α=0.01水平上回歸顯著（Pr＞F小于0.01）；失擬項（P=0.0889＞0.05），失擬項不顯著，因此模型選擇正確，復相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9541，說明模型可以解釋95.41%試驗所得埃博霉素B產(chǎn)量的變化，表明方程擬合較好，試驗結(jié)果和預測值之間具有較好的一致性。Y的變異系數(shù)CV表示試驗的精確度，CV值越高，試驗的可靠性越低，本試驗中CV值相對較低，說明了試驗操作可靠。

表7 回歸方程的方差分析

表8 回歸系數(shù)的t值檢驗

回歸方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗表明，模型一次項X1極顯著，X2顯著；二次項X1X1、X1X2、X2X2對響應值有顯著的影響，且X1（土豆淀粉）X2（脫脂奶粉）有交互作用，交互作用顯著，說明土豆淀粉、脫脂奶粉是該發(fā)酵過程的重要影響因素。

2.3.2 響應面分析及最佳培養(yǎng)基成分確定 利用SAS軟件根據(jù)回歸方程進行響應面分析，繪制響應面分析圖及其等高線圖，結(jié)果見圖1-3，考察所擬合的響應曲面的形狀，每個響應面分析圖分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第3個變量保持在中心點水平不變。從其等高線圖可以直觀看出兩因素的交互作用，等高線的形狀反映出交互作用效應的強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，等高線形狀越接近橢圓形表示交互作用越強。

回歸方程存在穩(wěn)定點，即存在極值點（X1，X2，X3）使得響應變量Y取得最大值。通過嶺脊分析（ridge analysis）得到極大值所對應的各主要因素（X1，X2，

X3）的編碼值分別為（0.747817，-0.57091，-0.33886），即馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉、無水氯化鈣的最佳濃度為3.8739 g/L、2.2145 g/L、1.3306 g/L，此時埃博霉素B產(chǎn)量達到最高為31.1036 mg/L。

圖1 Y= f（X1，X2）響應面立體分析圖

圖2 Y= f（X1，X3）響應面立體分析圖

圖3 Y= f（X2，X3）響應面立體分析圖

2.4 模型的驗證

在以上確定的最優(yōu)條件下進行3次平行驗證試驗，同時將優(yōu)化前培養(yǎng)基作為對照。優(yōu)化培養(yǎng)基埃博霉素B的平均產(chǎn)量為29.95 mg/L，預測結(jié)果31.1036與驗證試驗平均值十分接近，說明了試驗值和預測值之間具有良好的擬合性，模型的有效性，同時與初始發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的埃博霉素B（14.2 mg/L）相比產(chǎn)量提高了1.1倍。

3 討論

目前已有一些關(guān)于埃博霉素發(fā)酵合成的報道。韓莉莉等［3］采用單因子法研究培養(yǎng)基組成對埃博霉素產(chǎn)量的影響，使埃博霉素B產(chǎn)量達到7 mg/L左右，比原始條件提高了2.88倍；本實驗室前期通過正交實驗優(yōu)化纖維堆囊菌SoF5-09產(chǎn)埃博霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基，埃博霉素B產(chǎn)量為27.5 mg/L，提高了74%［7］；諸景光等［6］采用響應面法優(yōu)化埃博霉素的發(fā)酵條件，埃博霉素產(chǎn)量為14.12 mg/L，提高了18%。曹文瑞等［15］通過多步驟響應面法優(yōu)化So0157-2合成埃博霉素營養(yǎng)條件，使埃博霉素B產(chǎn)量達到82 mg/L，比優(yōu)化前提高了7.2倍，充分表明了響應面法優(yōu)化纖維堆囊菌野生菌合成埃博霉素營養(yǎng)條件的有效可行性。國外則更多的關(guān)注埃博霉素合成基因的易源表達及其臨床研究，關(guān)于發(fā)酵工藝方面報道較少。Lau等［16］采用半連續(xù)發(fā)酵法以及添加吸附樹脂等方法試圖提高異源菌株合成埃博霉素產(chǎn)量；Regentin等［4］對比了本源菌和異源宿主發(fā)酵合成埃博霉素過程中對銨離子、磷酸鹽以及鐵離子的耐受程度。然而埃博霉素產(chǎn)量的不穩(wěn)定性及產(chǎn)量有待進一步提高的問題仍是目前備受關(guān)注的焦點。由于纖維堆囊菌易受外界環(huán)境條件的影響，且表現(xiàn)出明顯的菌株特異性，為了提高纖維堆囊菌SoF5-76發(fā)酵產(chǎn)埃博霉素B的水平以降低生產(chǎn)成本，本研究從營養(yǎng)條件著手，在單因素試驗的基礎上通過Plackett-Burman設計從可能影響埃博霉素B產(chǎn)量的9個因素中篩選出3個顯著因素，并通過響應面法對其水平進行了優(yōu)化，最終得到纖維堆囊菌SoF5-76的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。在此最優(yōu)條件下，埃博霉素B產(chǎn)量（29.95mg/L）比優(yōu)化前（14.2 mg/L）提高了1.1倍。橫向比較，本試驗優(yōu)化水平還有提高的空間，且本試驗菌株的產(chǎn)量較穩(wěn)定。得到的優(yōu)化培養(yǎng)基相比初始培養(yǎng)基增加了VB12和脫脂奶粉兩個成分。VB12作為生長因子有利于菌體的生長，上述試驗表明脫脂奶粉是影響埃博霉素B產(chǎn)量的重要因素，這可能是

因為脫脂奶粉含有一些有利于菌體生長或埃博霉素B產(chǎn)生的氨基酸類，氨基酸可以提供大環(huán)內(nèi)酯類抗生素生物合成過程中所需要的前體物質(zhì)。據(jù)文獻報道［17］，前體氨基酸能促進大環(huán)內(nèi)酯類抗生素合成，但是沒有有關(guān)埃博霉素的報道，后續(xù)工作將基于埃博霉素B的生物合成途徑對埃博霉素B的發(fā)酵工藝進一步優(yōu)化，預期將獲得更高的發(fā)酵水平。

4 結(jié)論

對埃博霉素產(chǎn)量有顯著影響的3個因素為馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉和無水氯化鈣；在此最優(yōu)條件下，埃博霉素B產(chǎn)量可達到29.95 mg/L，發(fā)酵產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了1.1倍。用響應面法優(yōu)化纖維堆囊菌產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵培養(yǎng)基是有效可行的。

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Medium Optimization for Enhanced Production of Epothilone B by Sorangium cellulosum SoF5-76 Using Response Surface Methodology

Gong Guoli Wang Na Liu Lili
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021）

The response surface methodology（RSM）was employed to optimize the medium composition for Epothilone B produced by Sorangium cellulosum SoF5-76. On the basis of one-variable-at-a-time design, using Plackett-Burman design, potato starch, skimmed milk powder and calcium chloride were screened out of 9 factors as main affecting variables of Epothilone B production, and then steepest ascent method was used to approach their maximum response regions, followed by Box-Behnken design, multiple regression analysis and response surface analysis. The optimum medium formula determined was composed of potato starch 3.9 g/L, skim milk powder 2.2 g /L, chlorine calcium 1.3 g/L, glucose 1 g/L, soybean powder 1.5 g/L, magnesium sulfate 2.5 g/L, EDTA-Fe3+3 mL/L, trace elements 0.5 mL/L, VB121 mL/L. Under this optimal conditions, Epothilone B production reached up to 29.95 mg/L and increased 1.1 times in average as compared with preliminary culture and consistent with the maxmum predicted value.

Epothilone B Sorangium cellulosum Fermentation medium Response surface methodology optimization

2013-08-15

陜西省教育廳自然科學專項（12JK1023），國家自然科學基金項目（20906058）

龔國利，男，副教授，碩士生導師，研究方向：生物制藥技術(shù)；E-mail：gongguoli@sust.edu.cn