TLM合金在含蛋白質模擬體液中的腐蝕行為

黃偉九，劉成龍，余永梅，謝 霖

(重慶理工大學 材料科學與工程學院，重慶 400050)

20世紀中期，具有良好生相容性、綜合生物力學性能的鈦及鈦合金開始被應用于人工骨、整形外科、心臟外科等醫(yī)學領域。在臨床使用過程中，被廣泛使用的純鈦與Ti-6Al-4V存在力學相容性、植入物表面生物活性、耐磨性、耐蝕性等問題[1]。由此先后出現(xiàn)以Ti-5Al-2.5Fe與Ti-6Al-7Nb為代表的第二代α+β型鈦合金以及具有更好相容性和更低彈性模量的第三代β型鈦合金，如 Ti-12Mo-6Zr-2Fe、Ti-14Nb-13Zr、Ti-35Nb-5Ta-7Zr和 Ti-25Nb-3Zr-2Sn-3Mo 等[2-4]。

用于替代人體組織或器官的金屬材料植入人體時，材料表面最先與機體內的血液和組織液接觸。植入數秒后，繼水和無機鹽離子吸附后，蛋白質會通過分子傳遞、吸附、重排、交換、解吸等步驟競相吸附在材料表面，形成一層厚度為20~100 nm的蛋白質吸附層。該蛋白質吸附層不但會影響金屬表面的凝血、細胞及細菌黏附作用，而且會顯著金屬材料與植入環(huán)境間的界面反應[5-8]。鈦及鈦合金表面易形成一層厚度為幾納米~幾十納米的氧化膜，其植入物與組織間的界面作用主要與該氧化膜層相關。在生理環(huán)境(pH 7.2~7.4)中，鈦及鈦合金的表層氧化膜帶負電荷，而蛋白質分子的等電點一般低于生理環(huán)境的pH值，呈現(xiàn)負電性[9]。當植入物與機體的體液或血液接觸時，在靜電作用下 Ca2+離子首先吸附到材料表面使其帶正電，從而再吸附表面暴露酸性基團的蛋白質分子。此外，體液中的Mg2+也會起到一定的介導作用[10-11]。目前，對影響鈦及鈦合金腐蝕行為的蛋白質研究較為關注的是白蛋白(Albumin, Ab)、纖維蛋白原(Fibrinogen,Fb)和球蛋白。已有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質對純鈦及鈦合金腐蝕行為的影響大致可分為3類：沒有影響，促進或降低腐蝕速率。其影響效果主要與其表面的氧化膜狀態(tài)與生理環(huán)境存在直接的關系[12]。

本文作者以新開發(fā)的人工關節(jié)用近β型TLM合金為研究對象，研究其在含有免疫球蛋白G或牛血清白蛋白的PBS溶液中的腐蝕行為，從而得到上述兩種有機成分對其腐蝕行為的影響規(guī)律，為其臨床應用提供實驗與理論依據。

1 實驗

1.1 材料及腐蝕試樣的制備

實驗中所選用的材料為醫(yī)用 TLM 鈦合金，由西北有色金屬研究院提供。其化學成分如表1所列。

表1 實驗用TLM鈦合金的化學成分Table 1 Chemical composition of TLM alloy (mass fraction, %)

首先，將鈦合金板材加工成33 mm×23 mm×4.5 mm的長方體，然后依次用280~1200號金相砂紙逐級打磨，隨后分別用丙酮、酒精、二次蒸餾水進行超聲清洗10 min，冷風吹干后置于干燥器中待用。

1.2 實驗過程及方法

實驗中選用的模擬體液為PBS溶液(pH 7.4)，配方如下：NaCl(8.0 g/L)，KCl(0.2 g/L)，Na2HPO4(1.15 g/L)，KH2PO4(0.2 g/L)，采用HCl和NaOH溶液調節(jié)緩沖液 pH至 7.4。實驗過程中 PBS溶液溫度為(37±0.5) ℃。

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)與免疫球蛋白G(Immunoglobulin G, IgG)購自Sigma公司。考慮人血漿蛋白中白蛋白(38~48 g/L)與纖維蛋白原(2~4 g/L)的濃度，選擇一中間濃度值配置含蛋白的測試溶液。將凍干的IgG粉末溶于PBS緩沖溶液中，濃度為2.5 g/L，簡稱PBS+IgG溶液；將凍干的BSA粉末緩慢溶解于PBS緩沖溶液中，濃度為10 g/L，簡稱PBS+BSA溶液；將BSA與IgG粉末先后溶解于PBS緩沖溶液中，兩者濃度分別為 10 和 2.5 g/L，簡稱PBS+BSA+IgG溶液。

電化學腐蝕實驗采用三電極體系，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，Pt片為輔助電極，工作電極為測試試樣，測試面積為1 cm×1 cm。分別對浸泡期間的開路腐蝕電位、動態(tài)極化曲線與電化學交流阻抗譜進行測量。測量動態(tài)極化曲線時，將待測試樣進入實驗介質中，分別穩(wěn)定不同時間(1，6，24，48和72 h)后，進行極化測試。電位掃描速度為1 mV/s。電化學交流阻抗譜(Electrochemical impedance spectra, EIS)的測量所用正弦激勵信號幅值為10 mV，測試電位為工作電極的開路腐蝕電位(OCP)，頻率范圍100 kHz~10 mHz，數據分析軟件為ZView2。

采用配有能譜儀的電子掃描顯微鏡(JSM-6460LV)對腐蝕后的試樣表面進行腐蝕形貌觀察與微區(qū)成分分析。

2 實驗結果

2.1 開路腐蝕電位

TLM合金浸入4種測試溶液中不同時間后的開路腐蝕電位(Open circuit potential, OCP)變化規(guī)律如圖1所示。在PBS溶液中，合金的OCP值首先向正電位方向移動，然后向負電位方向移動，浸泡時間超過24 h后，OCP值逐漸穩(wěn)定在-0.15 V (vs SCE)左右。在PBS+ BSA溶液中，幾乎在任一時間點，合金的OCP值明顯比其在PBS溶液中的電位值要負。但電位值變化較小，浸泡時間超過1 h后，該值基本穩(wěn)定在-0.37 V左右。在PBS+IgG溶液中，合金的OCP值先向正方向移動，后負移。浸泡6 h后，該值基本穩(wěn)定在-0.23 V左右。與單獨加入IgG或BSA相比，在含有IgG (2.5 g/L)與BSA(10 g/L)的PBS溶液中，浸泡1 h后，TLM合金的OCP值就比其在PBS溶液中的電位值要正，浸泡時間達到24 h時，該值約為-0.03 V。開路腐蝕電位的高低表明材料腐蝕的傾向性大小，該電位值越負，材料越容易發(fā)生腐蝕[13]?？梢姡Ｑ灏椎鞍椎募尤肟蓪е耇LM合金在PBS溶液中的腐蝕傾向性增大。而免疫球蛋白G的影響作用與合金在溶液中的浸泡時間相關，浸泡超過6 h，合金在PBS溶液中的腐蝕傾向性變小。而當兩種蛋白質共同作用時，合金在PBS溶液中的溶解被顯著抑制。

圖1 TLM合金在PBS溶液、含IgG及BSA的PBS溶液中分別浸泡不同時間后的開路腐蝕電位變化Fig. 1 Variations of open circuit potential of TLM alloy in PBS simulated solution with and without IgG or BSA after immersion

2.2 電化學交流阻抗譜

當金屬材料植入人體后，首先發(fā)生水和無機鹽離子在材料表面的吸附，然后是蛋白質的吸附。蛋白質吸附層會顯著改變植入金屬材料表面鈍化膜的形成行為，影響其腐蝕行為[12]。為了進一步獲得 TLM 合金浸泡過程中表面鈍化膜的生長與溶解信息，進行了EIS測量，獲得的Bode圖如圖2所示。

從實驗獲得的TLM合金在4種測試溶液中的EIS可知，其 Nyquist圖都由兩個容抗弧構成：直徑較小的中高頻區(qū)容抗弧與直徑較大的低頻區(qū)容抗弧。隨著浸泡時間的延長，低頻區(qū)容抗弧直徑明顯改變。VASILESCU等[14]認為鈦合金在模擬體液中EIS中低頻區(qū)容抗弧直徑的變化緣于表面鈍化膜的變化。從圖2的Bode圖可知，存在兩個時間常數。PAN等[15]認為該類結果可以利用兩層氧化膜結構來模擬，內層致密層與外層疏松。在PBS中，使用Rs(QpRp)(QbRb)進行擬合，其中Rs表示測試溶液電阻，Rb表示表面致密氧化膜層電阻，Qb表示致密氧化膜層與溶液之間形成的電雙層常相位角元件，Rp表示表面疏松氧化膜層電阻，Qp表示疏松氧化膜層與溶液之間形成的電雙層常相位角元件；而在含有BSA與IgG的PBS溶液中，Bode圖中的相位角出現(xiàn)明顯變化，中頻區(qū)的相位角明顯較圖2(a)中的要大，而在高頻區(qū)的相位角較圖 2(a)中的要小。圖3所示為TLM合金在不同測試溶液中浸泡72 h后的EIS測量結果對比圖。在含有蛋白質的溶液中，使用Rs(QpRp)(CbRb)進行擬合。其中，Cb表示致密氧化膜層與溶液之間形成的電雙層電容。利用相應的等效電路對獲得的EIS結果進行擬合，實驗擬合誤差控制在10%以內，擬合結果見表2~5。

圖2 TLM合金在4種測試溶液中浸泡不同時間后的Bode圖Fig. 2 Effect of immersion period on Bode spectra of TLM alloy in four types of test solution: (a) PBS; (b) PBS+BSA(10 g/L);(c) PBS+IgG(2.5 g/L); (d) PBS+BSA(10 g/L)+IgG(2.5 g/L)

圖3 TLM合金在4種測試溶液中浸泡72 h后的Bode圖Fig. 3 Bode spectra of TLM alloy in four types of test solution after 72 h immersion

從擬合結果可知，牛血清白蛋白的加入對PBS溶液電阻的影響不大，而免疫球蛋白G則明顯導致溶液電阻的降低。此外，與TLM合金在PBS溶液中的實驗結果相比，牛血清白蛋白的加入明顯導致合金內層氧化膜電阻降低，而免疫球蛋白G的影響則與之相反?？梢姡Ｑ灏椎鞍着c免疫球蛋白G在PBS溶液中的存在的確會導致合金表面氧化膜的變化。

圖4所示為TLM合金在不同測試溶液中測得的動態(tài)極化曲線。圖5所示為TLM合金在不同測試溶液中浸泡72 h后的動態(tài)極化曲線對比圖。利用Tafel外推法，獲得其腐蝕電流密度，如表6所列。由圖4可知，雖然合金在 4種測試溶液中都出現(xiàn)明顯的活化-鈍化行為，但存在明顯的區(qū)別。在PBS溶液中浸泡24 h后，合金從陽極活化進入鈍化的時間明顯縮短，在腐蝕電位約為-0.3 V (vs SCE)時由活化轉變?yōu)殁g化狀態(tài)，而浸泡1 h和6 h后，在腐蝕電位超過0.02 V時才由活化轉變?yōu)殁g化。在PBS+BSA溶液中浸泡6 h后，腐蝕電位達到-0.6 V時，合金的腐蝕電流密度隨著腐蝕電位的升高而維持不變，出現(xiàn)第一次鈍化。第一次鈍化的電流密度隨著浸泡時間的延長而降低；當腐蝕電位達到-0.3 V左右時，電流密度隨著電位的增大而增加；當電位達到0.3 V左右時，合金進入第二次鈍化，鈍化電流密度約為 6.0×10-7A/cm2。在PBS+IgG、PBS+BSA+IgG溶液中，浸泡6 h后的第一次鈍化區(qū)間則比其在 PBS+BSA溶液中的要寬，在PBS+IgG溶液中，第一次鈍化區(qū)間約為-0.2~0.2 V，鈍化電流密度約為1.0×10-6A/cm2，而在PBS+BSA+IgG溶液中，第一次鈍化區(qū)間約為-0.2~0.3 V，鈍化電流密度約為8.0×10-7A/cm2。

表2 在PBS溶液中浸泡不同時間后TLM合金的電化學交流阻抗譜擬合數據Table 2 Fitting parameters of TLM alloy after immersion in PBS solution for different times by equivalent circuit (EC)from EIS data

表3 在PBS+BSA溶液中浸泡不同時間后TLM合金的電化學交流阻抗譜擬合數據Table 3 Fitting parameters of TLM alloy after immersion in PBS+BSA solution for different times by equivalent circuit (EC)from EIS data

表4 在PBS+IgG溶液中浸泡不同時間后TLM合金的電化學交流阻抗譜擬合數據Table 4 Fitting parameters of TLM alloy after immersion in PBS+IgG solution for different times by equivalent circuit (EC)from EIS data

表5 在PBS+BSA+IgG溶液中浸泡不同時間后TLM合金的電化學交流阻抗譜擬合數據Table 5 Fitting parameters of TLM alloy after immersion in PBS+BSA+IgG solution for different times by equivalent circuit (EC) from EIS data

圖4 TLM合金在4種測試溶液中的動態(tài)極化曲線Fig. 4 Potentiodynamic polarization curves for TLM alloy in four types of test solution: (a) PBS; (b) PBS+BSA(10 g/L); (c)PBS+IgG(2.5 g/L); (d) PBS+BSA (10 g/L)+IgG(2.5 g/L)

圖5 TLM合金在4種測試溶液中浸泡72 h后的動態(tài)極化曲線Fig. 5 Potentiodynamic polarization curves for TLM alloy in four types of test solution after 72 h immersion

表6 TLM合金在4種測試溶液中浸泡不同時間后的腐蝕電流密度變化Table 6 Variations of corrosion current density of TLM alloy in four types of test solution after different immersion periods

圖6所示為TLM合金在PBS+BSA溶液中動態(tài)極化后的腐蝕表面形貌，腐蝕后的 TLM 表面發(fā)生孔蝕現(xiàn)象，腐蝕跡象多出現(xiàn)在加工后留下的表面缺陷位置，在其他溶液中獲得的腐蝕形貌與其類似。通過能譜儀分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生孔蝕的位置無Nb元素存在或微量。

3 討論

開路腐蝕電位、EIS及動態(tài)極化曲線的測試結果都表明，白蛋白與免疫球蛋白G的確會影響TLM合金在PBS溶液中的腐蝕行為。

3.1 白蛋白對TLM合金腐蝕行為的影響

PETERS[16]，HODGSON 等[17]，CONTU 等[18]曾研究了白蛋白在純鈦表面的吸附，發(fā)現(xiàn)白蛋白分子吸附到純鈦表面后會變?yōu)楸馄綘睿采w完整的白蛋白吸附層會抑制腐蝕性離子從溶液到金屬表面的遷移或氧的擴散。

從開路腐蝕電位的測量結果(見圖1)可知，在任一浸泡時間點，TLM 合金在含有牛血清白蛋白的 PBS溶液中的OCP值明顯比其在PBS溶液中的要負。在PBS+BSA溶液中浸泡1 h后，該值基本穩(wěn)定在-0.37 V左右，而在PBS溶液中浸泡時間超過24 h后，OCP值逐漸穩(wěn)定在-0.15 V左右，兩者相差約0.22 V。從TLM合金在上述兩種溶液中的EIS測量結果(見表2)可知，Rb表示表面致密氧化膜層電阻，Rp表示表面疏松氧化膜層電阻，兩者之和表征鈍化膜的電阻。在PBS+BSA溶液中，(Rb+Rp)值明顯小于 TLM 合金在PBS溶液中的測得值。此外，動態(tài)極化曲線測量結果表明浸泡時間超過24 h后，合金陽極活化向鈍化的轉化速度加快。合金在PBS溶液中浸泡24 h后，第一次鈍化電流密度大約在1.3×10-6A/cm2，而在PBS+BSA溶液中浸泡 24~72 h后，第一次鈍化電流密度約從1.4×10-6A/cm2逐漸降低到7.3×10-7A/cm2，其腐蝕電流密度也略有降低?？梢姡椎鞍啄軌蛟谝欢ǔ潭壬弦种芓LM合金在PBS溶液中的腐蝕。如果僅從合金表面氧化膜的電阻變化來看，動態(tài)極化曲線與OCP、EIS的測量結果是相矛盾的。但是，CONTU等[18]和TAKEMOTO等[19]認為白蛋白在鈦及鈦合金表面的吸附是動態(tài)的，隨著浸泡時間的延長，白蛋白分子在材料表面的吸附覆蓋率會逐漸提高，從而有效抑制腐蝕性離子的侵入，阻礙材料的腐蝕。從表2中Qp的變化可知，在PBS+BSA溶液中，該值逐漸降低，這表明氧化膜表面吸附的白蛋白分子吸附層逐漸變得致密[19-20]，從而降低氧原子的擴散或腐蝕產物擴散至溶液中的速率，導致 TLM 合金在該溶液中腐蝕速率的下降。此外，開路腐蝕電位反映了材料的熱力學特性和電極的表面狀態(tài)，該值的變化可歸因于氧還原反應或材料的陽極溶解，當其隨時間的變化趨于“正”，常常表示保護膜增強了，可能緣于溶液中氧的作用或腐蝕產物組成了新的保護膜[13]。開路腐蝕電位變負與TLM 合金表面內層氧化膜電阻的降低可能源于白蛋白分子與TLM合金表面氧化膜之間形成的螯合作用與阻擋效應的聯(lián)合作用。螯合作用會導致在開路狀態(tài)下合金氧化膜的溶液，而阻擋效應會降低氧原子或離子的遷移與電荷的傳輸，從而抑制內層氧化膜的生長[18, 21]。

3.2 免疫球蛋白G對TLM合金腐蝕行為的影響

JANSSON 等[20]研究發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白非常容易吸附在親水性的多孔純鈦表面，其吸附量隨著浸泡時間的延長與蛋白濃度的提高而增大。蛋白分子主要通過鈦及鈦合金表面的Ti—OH鍵來實現(xiàn)吸附[22]。

TLM合金在PBS+IgG溶液中浸泡1 h時，其OCP值比其在PBS溶液中的值負，但是隨著浸泡時間的延長，其OCP值逐漸變正，這表明浸泡時間的延長有助于增強合金表面氧化膜層抑制腐蝕的作用。從EIS測量結果(見表 4)可知，當浸泡時間 6 h后，合金在PBS+IgG溶液中的(Rb+Rp)值明顯高于其在 PBS溶液中浸泡相同時間的值。其中，Rp隨著浸泡時間的增加而逐漸降低，但變化的幅度不大；與之相比，Rb值的增加較為顯著，在浸泡1 h時僅為3.01×104Ω，而浸泡72 h后，Rb值達到3.96×105Ω，提高了一個數量級，這表明免疫球蛋白G吸附層有利于結合自由氧離子，促進 TLM 合金表面氧化膜的生長[23]。氧化膜的生長有利于降低材料的腐蝕速率，這一點從動態(tài)極化曲線的測試結果得到進一步證明。表6中的數據表明TLM合金在PBS+IgG溶液中的腐蝕電流密度隨著浸泡時間的增加而逐漸降低。與白蛋白相比，免疫球蛋白G主要通過促進氧化膜的生長來提高TLM合金在PBS溶液中的腐蝕抵抗力。

3.3 白蛋白與免疫球蛋白G聯(lián)合作用對TLM合金腐蝕行為的影響

根據合金在含有白蛋白與免疫球蛋白 G的 PBS溶液中的開路腐蝕電位變化可知，兩種蛋白質的聯(lián)合作用可更加有效地降低 TLM 合金的腐蝕傾向性，尤其在浸泡24 h時，開路腐蝕電位為-0.03 V左右。EIS測試結果也證實了在兩種吸附蛋白質的共同作用下，TLM 表面內層氧化膜的電阻顯著增大，在浸泡 24 h時，該值可達到6.83×105Ω，比TLM合金在PBS中浸泡24 h時的內層氧化膜電阻約提高一個數量級。腐蝕電流密度的變化也進一步證明兩種蛋白質的共同吸附更有利于降低TLM在PBS溶液中的腐蝕速率。

綜合白蛋白或免疫球蛋白G單獨對TLM合金腐蝕行為的影響，白蛋白的吸附不利于 TLM 合金內層氧化膜的生長，但對外層疏松氧化膜的電阻影響不大；與之相比，免疫球蛋白G的吸附有利于TLM合金內層氧化膜的生長，但會明顯導致外層疏松氧化膜電阻的下降。對抑制合金腐蝕的作用而言，在相同的浸泡時間內，TLM合金在兩種測試溶液中的腐蝕電流密度相差不大，在PBS+IgG溶液中的腐蝕電流密度略低一些。這可能緣于兩種蛋白質的不同結構，白蛋白分子的橫徑尺寸約為56 nm2，在吸附到材料表面后可形成致密的球形結構[23]，而免疫球蛋白G的橫徑尺寸約為140 nm2，免疫球蛋白分子的結構域具有典型的三維結構[24]。因此，較為致密的白蛋白吸附層更有利于抑制合金與溶液間的氧原子或離子遷移，從而抑制合金表面氧化膜的生長，但由于白蛋白分子與鈦離子間的螯合作用導致其腐蝕電流密度較高；相反，較為疏松的免疫球蛋白G吸附層有利于合金與溶液間的氧原子或離子遷移，促進合金表面氧化膜的生長，從而降低合金的腐蝕電流密度。兩者相比，免疫球蛋白G對TLM合金的腐蝕行為影響作用更大。綜合比較，TLM合金在上述4種測試溶液中都具有較優(yōu)的耐腐蝕性能。

4 結論

1) TLM合金在PBS模擬體液中具有良好的耐腐蝕性能，腐蝕以點蝕為主。合金的鈍化膜電阻隨浸泡時間的延長而增大，浸泡24 h后，開路腐蝕電位穩(wěn)定在-0.15 V左右，腐蝕電流密度穩(wěn)定在2.8×10-7A/cm2左右。

2) 白蛋白與免疫球蛋白 G的單獨加入都可抑制TLM合金在PBS溶液中的腐蝕，其中白蛋白主要通過抑制腐蝕性離子的侵入來實現(xiàn)，而免疫球蛋白G主要通過提高 TLM 合金表面氧化膜的電阻來實現(xiàn)。兩者共同作用抑制TLM合金腐蝕的效果更強。

3) EIS測試結果表明TLM合金表面的氧化層可分為兩層：內層致密層和外層疏松層。白蛋白在TLM合金表面的吸附可抑制其內層致密氧化層的生長，而免疫球蛋白G在TLM合金表面的吸附可促進其內層致密氧化層的生長。

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