紅色毛癬菌菌落表型和基因型的分型研究

閆 瑋占 萍陳 偉胡素泉劉維達?

·論著·

紅色毛癬菌菌落表型和基因型的分型研究

閆 瑋1占 萍2陳 偉1胡素泉1劉維達1?

目的: 確定紅色毛癬菌菌落表型和基因型的相關(guān)性以及與感染部位的關(guān)系。方法: 收集紅色毛癬菌臨床分離株138株,采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對紅色毛癬菌進行表型分型,利用紅色毛癬菌特異性引物擴增TRS－1區(qū)重復(fù)序列進行種內(nèi)基因分型,并分析檢測結(jié)果與感染部位的相關(guān)性。結(jié)果: 138株紅色毛癬菌共分離出3種菌落表型:絨毛型、溝紋型和粉末型；分離出5型基因型,其中Type1 64株,Type2 18株,Type3 19株,Type4 12株,Type5 25株。紅色毛癬菌的表型和基因型與感染部位均無相關(guān)性(均P＞0.05),紅色毛癬菌的菌落表型與基因型有一定的相關(guān)性(P＜0.05)。結(jié)論: 紅色毛癬菌基因型與菌株來源有關(guān)而與感染部位無關(guān),可為判斷復(fù)發(fā)和再感染提供依據(jù)。

紅色毛癬菌； 菌落表型； 基因型

紅色毛癬菌在PDA培養(yǎng)基上可分出不同的菌落形態(tài),按傳統(tǒng)方法可分為5型:羊毛型、絨毛型、溝紋型、粉末型和顆粒型,由于羊毛型和絨毛型不易區(qū)分,所以本文將紅色毛癬菌的表型分為絨毛型、溝紋型、粉末型和顆粒型。紅色毛癬菌的基因分型方法很多,但種內(nèi)特異性不高,本文利用紅色毛癬菌特異性引物,擴增TRS－1區(qū)的重復(fù)串聯(lián)序列得到5種基因型,并進一步探討表型與基因型的關(guān)系,以及兩者與感染部位的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 受試菌株來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所真菌科。其中手足癬77株,體股癬26株,甲癬35株。實驗所用紅色毛癬菌(菌號T1a)和須癬毛癬菌(菌號T5b)標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學(xué)真菌中心提供。

1.2 菌種鑒定 采用玻片小培養(yǎng),紅色毛癬菌鏡下見棒狀大分生孢子和淚滴狀小分生孢子。毛發(fā)穿孔試驗陰性以及尿素酶試驗陰性。

1.3 試劑及儀器 DNA提取及電泳試劑由南京生興生物技術(shù)有限公司提供,Taq酶、引物及DNA marker由上海生物工程有限公司提供。DNA擴增儀為BIORAD公司生產(chǎn)。

1.4 表型分型 將菌株用點種法接種到PDA平皿上,置28℃恒溫箱孵育10 d,體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.5 基因分型 采用凍融法提取DNA,1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,判斷提取率。以TrNTSF－2(5'－ACCGTATTAAGCTAGCGCTGC－3')、TrNTSR－4(5'－TGCCACTTCGATTAGGAGGC－3')為引物擴增TRS－1區(qū)的重復(fù)串聯(lián)序列,TRS－1區(qū)PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性45 s,55℃退火30 s,74℃延伸2 min,30個循環(huán),最后74℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測:1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,凝膠程序系統(tǒng)觀察結(jié)果并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 表型與感染部位的相關(guān)性 138株紅色毛癬菌在PDA培養(yǎng)基上分出3種表型:粉末型、溝紋型和絨毛型(圖1)。其中粉末型26株,溝紋型16株,絨毛型96株,表型與感染部位經(jīng)卡方檢驗無相關(guān)性(χ2＝5.32,P＞0.05),見表1。

圖1 紅色毛癬菌的菌落形態(tài)

表1 紅色毛癬菌表型與感染部位的關(guān)系

2.2 表型與基因型的相關(guān)性 采用紅色毛癬菌特異性引物擴增TRS－1區(qū)的重復(fù)串聯(lián)序列,根據(jù)條帶不同可分為5型。Type 1為單條帶,400 bp,Type2為600 bp單帶或600 bp、400 bp兩帶,Type 3為800 bp、600 bp、400 bp 3帶,Type 4為1000 bp、800 bp、600 bp和400 bp 4帶,其余帶型較少見,不再細(xì)分,統(tǒng)歸為Type 5,200 bp×n不定。本文138株紅色毛癬菌分出5種帶型,Type1 64株,Type2 18株,Type 3 19株, Type4 12株,Type5 25株(圖2)?；蛐团c感染部位無相關(guān)性(χ2＝9.56,P＞0.05),見表2。表型與基因型經(jīng)卡方檢驗有一定的相關(guān)性(χ2＝21.18,P＜0.05),見表3。

圖2 本實驗中TRS－1擴增基因型

表2 紅色毛癬菌基因型與感染部位的關(guān)系

表3 紅色毛癬菌表型與基因型的關(guān)系

3 討論

本研究中我們共收集了138株紅色毛癬菌臨床株,其中手足癬77株,甲癬35株,體股癬26株,采用傳統(tǒng)的表型分型方法,將其分為絨毛型(96株)、溝紋型(16株)和粉末型(26),其中絨毛型致病率最高。紅色毛癬菌基因分型方法有很多,Jackson等1報道了紅色毛癬菌NTS區(qū)的兩個高變區(qū):TRS－1區(qū)和TRS－2區(qū)。TRS－2區(qū)變異小,條帶單一,因此我們選用擴增TRS－1區(qū)來進行種內(nèi)分型,分為5種帶型:Type1占46.4%,Type2占13.0%,Type3占13.8%,Type4占8.7%,Type5占18.1%。與Jackson等1和Santos等2的分型結(jié)果相近。何曉丹等3也通過幾種方法的比較發(fā)現(xiàn)TRS－l區(qū)PCR指紋圖譜最適合用于紅毛種內(nèi)分型。Hryncewicz等4通過TRS和RAPD兩種分型方法比較,發(fā)現(xiàn)前者的可重復(fù)性更好。

楊國玲等5用探針與DNA印跡法研究紅色毛癬菌的基因分型,發(fā)現(xiàn)它們與傳統(tǒng)的菌落表型有一定的關(guān)系,由于試驗菌株數(shù)較少,與臨床發(fā)病部位和菌株來源地區(qū)的關(guān)系尚不能得出確切的結(jié)論。成曉茹等6用RAPD法分析紅色毛癬菌基因型,并與傳統(tǒng)的表型分型相比較,未發(fā)現(xiàn)基因型與表型的對應(yīng)關(guān)系。實驗中我們比較了不同部位菌株的帶型分布,發(fā)現(xiàn)紅色毛癬菌菌株TRS－1區(qū)分型與菌株的感染部位無明顯相關(guān)性。樊建峰等7用該法對不同部位菌株進行基因分型得出了與本研究相同的結(jié)論。

紅色毛癬菌經(jīng)傳代后表型具有不穩(wěn)定性,楊國玲等8發(fā)現(xiàn)紅色毛癬菌菌株在20代傳代過程中發(fā)生多次表型變異,且變異可逆轉(zhuǎn),同一菌株的原代與20代PCR擴增指紋圖一致,基因序列亦基本一致。Baeza等9分析紅色毛癬菌基因型與流行病學(xué)的關(guān)系時發(fā)現(xiàn),有關(guān)聯(lián)的臨床菌株其基因型有高度的相似性,來自同一家孤兒院的分離株基因型相似系數(shù)＞90%,根據(jù)Chong等10觀點可認(rèn)為這些感染菌株可能由單一菌株進化而來。占萍等11在進行兩足一手型手足癬病例分析時發(fā)現(xiàn)80%以上的患者手足部位菌株基因型相同,進一步說明了紅色毛癬菌基因型與菌株來源有關(guān)而與感染部位無關(guān)。

本研究的不足之處是未進行TRS－2區(qū)分型,盡管此區(qū)只能分出兩種帶型,但是如果TRS－1區(qū)和TRS－2區(qū)分型相結(jié)合可將紅色毛癬菌分出更多的帶型,能更清楚的確定傳染來源,區(qū)分復(fù)發(fā)和再傳染。

1 Jackson CJ,Barton RC,Kelly SL,et al.Strain identification of Trichophyton rubrum by specific amplification of subrepeat elements in the ribosomal DNA nontranscribed spacer.Clin Microbiol,2000,38(12):4527－4534.

2 de Assis Santos D,de Carvalho Araújo RA,Kohler LM,et al. Molecular typing and antifungal susceptibility of Trichophyton rubrum isolates from patientswith onychomycosis pre－and posttreatment.Int JAntimicrob Agents,2007,29(5):563－569.

3何曉丹,冉玉平,代亞玲,等.家庭內(nèi)紅色毛癬菌病患者間菌株差異性分析.中國真菌學(xué)雜志,2010,5(1):5－8.

4 Hryncewicz－Gwóz'dz'A,Jagielski T,Sadakierska－Chudy A,et al.Molecular typing of Trichophyton rubrum clinical isolates from Poland.Mycoses,2011,54(6):e726－736.

5楊國玲,李喬,于曉虹,等.紅色毛癬菌基因型與表型的研究.中華皮膚科雜志,2003,36(12):682－684.

6成曉茹,吳愛軍,張建秀,等.紅色毛癬菌隨機擴增DNA多態(tài)性分型研究.中華皮膚科雜志,2001,34(6):448－449.

7樊建峰,李恒進,索繼江,等.紅色毛癬菌種內(nèi)分型.軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報,2004,25(3):225－226.

8楊國玲,杜迎春,張明莉,等.傳代對紅色毛癬菌表型和核糖體基因影響的研究.中國皮膚性病學(xué)雜志,2007,21(5):263－266.

9Baeza LC,Matsumoto MT,Almeida AM,etal.Strain differentiation of Trichophyton rubrum by randomly amplified polymorphic DNA and analysis of rDNA nontranscribed spacer.JMed Microbiol,2006,55(4):429－436.

10 Chong PP,Lee YL,Tan BC,et al.Genetic relatednessof Candida strains isolated from women with vaginal candidiasis in Malaysia.JMed Microbiol,2003,52(8):657－666.

11占萍,呂雪蓮,佘曉東,等.兩足一手型手足癬致病菌種紅色毛癬菌的基因型分析.中國皮膚性病學(xué)雜志,2009,23(1):3－5.

(收稿:2013－08－06 修回:2013－09－15)

A study on colony phenotyping and genotyping of Trichophyton rubrum

YANWei,ZHAN Ping,CHENWei,et al.Institute of Dermatology,Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing,210042

Objective:To determ ine the characteristics of colony phenotyping and genetyping of Trichophyton rubrum and the relationship with infection sites.Methods:Using the traditional cultivationmethod to discriminate the colony phenotypes of 138 stains of Trichophyton rubrum and typed by PCR amp lification of tandermly repetive elements(TRSs)TRS－1 from the ribosomal DNA nontranscribed spacer region(NTS).The results of the tests and the infection sites were analyzed.Results:The colonies of 138 Trichophyton rubrum were classified into three types,including downy type,furrowed type and powdery type,and 5 genotypes(the number of the genotypes 1,2,3,4,5 was 64,18,19,12,25).The colony morphology of Trichopyton rubrum wasno related with infection sites(P＞0.05).Therewasno significant difference between infection sites and genotypes(P＞0.05).The conoly phenotype was correlated with genotype(P＜0.05).Conclusion:Genotype and colony phenotype of Trichopyton rubrum were correlated and can be used in differential diagnosis of new infection and relapse.

Trichopyton rubrum；colony phenotyping；genotyping

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所,江蘇南京,210042

2江西省皮膚病?？漆t(yī)院,南昌,350001

?通信作者