miR-124a通過抑制TGF-β通路促進(jìn)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺祖細(xì)胞分化

陳冬梅，馬海濱，劉淑丹，王立斌，李玉奎，魏 軍

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院干細(xì)胞研究所生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川750004)

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placenta mesenchymal stem cells，PMSCs)，免疫原性低［1］，具有跨胚層分化為內(nèi)胚層來源細(xì)胞的潛能，可能成為β 細(xì)胞缺失替代治療的重要方法［2］。研究顯示組織特異性轉(zhuǎn)錄因子的異源表達(dá)能夠有效提高間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向胰島素生成細(xì)胞分化，例如:外源過表達(dá)PDX-1 能夠產(chǎn)生具有糖反應(yīng)能力的胰島素生成細(xì)胞［3］。同樣外源過表達(dá)組織特異的微小RNA(microRNA，miRNA)也能夠調(diào)控細(xì)胞的表型。目前還沒有利用外源表達(dá)miRNA 成功獲得胰島素生成細(xì)胞的報道。胚胎發(fā)育過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是細(xì)胞分化的重要事件，這一過程中TGF-β 信號起了主導(dǎo)作用［4］。本研究試圖通過研究miR-124a 參與的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，通過抑制TGF-β 信號通路受體:轉(zhuǎn)化生長因子β Ⅰ型受體(transforming growth factor beta type Ⅰreceptor，TGFBR1)和骨形成蛋白β Ⅰ型受體(bone morphogenic proteins receptor type ⅠB，BMPR1B)的表達(dá)，阻斷TGF-β 信號通路，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition，MET)，同時阻止細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)PMSCs 向胰腺祖細(xì)胞的分化，為進(jìn)一步獲得胰腺功能細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胎盤來源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院行剖腹產(chǎn)的健康產(chǎn)婦，經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)且獲得患者知情同意。HEK293FT 細(xì)胞(寧夏人類干細(xì)胞研究所保存)。胎牛血清、L-DMEM、H-DMEM、胰蛋白酶和Trizol(Invitrogen 公司);Activin A(R＆D 公司);DNA酶Ⅰ、A 型膠原蛋白酶(Roche 公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑TurboFect 和qPCR 試劑盒(Thermo 公司);限制性內(nèi)切酶，T4 連接酶和T-載體(TAKARA 公司);四環(huán)素誘導(dǎo)型慢病毒載體系統(tǒng)Tet-On 3G(Clontech公司);山羊抗人多克隆抗體Insulin 和PDX-1(Santa cruz 公司);CY3 和FITC 標(biāo)記兔抗山羊二抗(博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人胎盤胎兒側(cè)MSCs 分離培養(yǎng)及鑒定見參考文獻(xiàn)［5］。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基:DMEM 高糖添加100 mL/L 胎牛血清，8 ng/mL bFGF，4 nmol/L Activin A。

1.2.2 生物信息學(xué)分析與靶基因預(yù)測:利用star-Base v2.0 綜合分析各預(yù)測軟件的結(jié)果，搜索hsamiR-124a 的靶基因并取交集，GO 分析TGF-β 通路相關(guān)的基因。

1.2.3 細(xì)胞RNA 提取及實(shí)時定量PCR 檢測:Trizol提取樣本總RNA 后，紫外分光光度計(jì)和電泳檢測RNA 濃度、純度和完整性。通過隨機(jī)引物體外反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，用SYBR Green 染料法獲得不同樣本中目的基因的相對表達(dá)量。通過2－ΔΔCt算法，計(jì)算統(tǒng)計(jì)分析目的基因mRNA 相對內(nèi)參GAPDH 基因表達(dá)水平的差異。microRNA 的檢測則通過特異的stem-loop 頸環(huán)引物體外反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，獲得不同樣本中microRNA 相對內(nèi)參U6 表達(dá)水平的差異，引物序列見表1。

1.2.4 pri-hsa-miR-124a 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與病毒包裝及細(xì)胞感染:以人基因組DNA 為模板，在miR-124a 初始轉(zhuǎn)錄(primary，pri)序列前后100 bp 左右位置設(shè)計(jì)克隆引物，添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，擴(kuò)增pri-miR-124a 目的片段。目的片段經(jīng)過T-載體擴(kuò)增，酶切、純化、回收后連接入病毒載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，并進(jìn)行酶切與測序鑒定。重組慢病毒載體pLVX-TRE3-miR-124a用TurboFect 轉(zhuǎn)染293FT 包裝細(xì)胞，收取上清獲取感染性病毒。感染293FT 方法測定病毒滴度，最終以MOI=10 的感染復(fù)數(shù)感染人胎盤胎兒側(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞(n=3)。

1.2.5 hsa-miR-124a antagomir 抑制物的合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染:hsa-miR-124a 反義寡核苷酸(antagomir)及陰性對照由上海吉瑪公司合成，序列見表2。合成的antagomir 用DEPC 水溶解成濃度為20 μmol/L的溶液，將opti-MEM 培養(yǎng)液400 μL 與antagomir和陰性對照各5 μL 充分混和，再與轉(zhuǎn)染試劑TurboFect 6 μL混合，將最終混合物加入含新鮮培養(yǎng)基的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞中，在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，換液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取RNA 供檢測。

1.2.6 免疫熒光染色:各處理組細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.3% TritonX-100 細(xì)胞膜穿孔10 min，根據(jù)二抗選擇山羊或兔血清封閉，次序與一抗、熒光標(biāo)記二抗孵育、洗滌，同時設(shè)置以PBS 緩沖液代替一抗，其他步驟不變的空白對照，DAPI 染核，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞特異性發(fā)光情況。

1.2.7 Western blot 分析:提取樣本總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，等量上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉，次序與一抗、二抗孵育，利用ECL 法檢測目的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)由SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析及LSD 多重比較。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析與靶基因預(yù)測

starBase v2.0 分析hsa-miR-124a 的作用靶點(diǎn)，其中與TGF-β 信號通路功能相關(guān)的靶基因包括ACVR2B，BMP6，BMPR1B，E2F5，MAPK1，RBL1，ROCK2，RPS6KB1，SMAD5，SP1 和TGFBR1，本實(shí)驗(yàn)選取TGF-β 通路的TGF-β 信號受體TGFBR1 和BMP 信號受體BMPR1B 進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 用于qPCR 和hsa-miR-124a 克隆的引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR and hsa-miR-124a cloning

表2 miR-124a 反義寡核苷酸序列Table 2 miR-124a antisense oligonucleotides sequence

2.2 Pri-hsa-miR-124a 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，病毒包裝及細(xì)胞感染

實(shí)驗(yàn)從基因組中擴(kuò)增獲得333 bp 的pri-hsamiR-124a 序列，通過Mlu Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)克隆至pLVX-TRE3G 載體中并測序正確，載體構(gòu)建成功。將重組載體pLVX-TRE3G-miR124a 與四環(huán)素誘導(dǎo)載體pLVX-TET 分別混合包裝質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生融合、皺縮病變(圖1A)。GFP 陽性對照顯示病毒感染效率在80%以上(圖1B)。用MOI 為10 的病毒上清感染胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，感染后兩周觀察細(xì)胞形態(tài)，部分細(xì)胞由之前的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(圖1C)轉(zhuǎn)變?yōu)橐认僮婕?xì)胞具有的上皮細(xì)胞形態(tài)(圖1D)。

2.3 miR-124a 過表達(dá)和抑制表達(dá)對靶基因TGFBR1和BMPR1B 的表達(dá)調(diào)控

miR-124a 重組慢病毒感染胎盤PMSCs 后檢測細(xì)胞中miR-124a 過表達(dá)情況，結(jié)果顯示感染后的細(xì)胞中成熟miR-124a 相對U6 的表達(dá)量增高，而其靶基因TGFBR1 和BMPR1B 相對GAPDH 的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染前降低(P＜0.05)(圖2A，B)。

合成的miR-124a 抑制物轉(zhuǎn)染胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞后，細(xì)胞中miR-124a 的表達(dá)較空白對照組下降，而其靶基因TGFBR1 和BMPR1B 表達(dá)上升(P＜0.05)(圖2C，D)。

2.4 胰腺祖細(xì)胞特征基因表達(dá)變化

試驗(yàn)檢測了miR-124a 過表達(dá)前后，胰腺祖細(xì)胞特異性基因Ngn3、PDX-1、Nkx6.1 和胰腺β 細(xì)胞標(biāo)志基因Insulin 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示相對GAPDH的表達(dá)量均呈現(xiàn)上升，其中Ngn3、Nkx6.1 和PDX-1表達(dá)差異極顯著(P＜0.01)，Insulin 的表達(dá)差異顯著(P＜0.05)(圖3A)。過表達(dá)miR-124a 使胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)胰腺祖細(xì)胞標(biāo)志蛋白PDX-1，同時檢測出胰島素蛋白表達(dá)(圖3B)。

2.5 miR-124a 過表達(dá)的PMSCs 中胰腺祖細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)

過表達(dá)miR-124a 后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)PDX-1 和Insulin 蛋白的細(xì)胞數(shù)量較轉(zhuǎn)染前明顯增多(圖4)。

圖1 慢病毒包裝與PMSCs 細(xì)胞感染Fig 1 Lentiviral packaging and PMSCs infection

圖2 miR-124a 與其靶基因的調(diào)控關(guān)系Fig 2 Relationship between miR-124a and its target genes

圖3 miR-124a 及其靶基因?qū)ο掠位蛘{(diào)控關(guān)系Fig 3 miR-124a and its targets are involved in regulation of the downstream genes

圖4 胰腺祖細(xì)胞特異蛋白表達(dá)Fig 4 Expression of pancreatic progenitor cellspecific protein

3 討論

PMSCs 為獲取低免疫原性的胰島素分泌細(xì)胞提供了可能。胰腺的發(fā)育經(jīng)歷終末內(nèi)胚層，胰腺祖細(xì)胞，內(nèi)分泌祖細(xì)胞和成熟β 細(xì)胞等多個關(guān)鍵事件，已有研究顯示，終末內(nèi)胚層的分化能夠有效地獲得，但胰腺祖細(xì)胞和功能性β 細(xì)胞在體外還不能很有效的分化。如何提高PMSCs 向胰腺祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力，對糖尿病和胰腺功能退化等疾病的臨床細(xì)胞治療有重要應(yīng)用價值。借助外源基因的表達(dá)能夠促進(jìn)MSCs 向內(nèi)分泌細(xì)胞的分化已有研究報道，例如轉(zhuǎn)錄因子PDX-1，MAFA，NGN3 等都能夠誘導(dǎo)MSCs 向胰島細(xì)胞分化［6-7］。研究表明在小鼠胚胎發(fā)育中，miR-124 通過抑制靶基因PTBP1，Sox9，NeuroD1 的表達(dá)，促進(jìn)祖細(xì)胞向成熟神經(jīng)元的分化［8］。同時研究發(fā)現(xiàn)發(fā)育過程中的神經(jīng)祖細(xì)胞和胰島祖細(xì)胞的表型有許多相似之處，研究顯示作為miR-124a 參與調(diào)控的NeuroD1，Sox9 和PAX6 可能間接調(diào)控胰腺發(fā)育的關(guān)鍵基因PDX1，而參與調(diào)控胰腺祖細(xì)胞的形成［9］。本研究結(jié)果說明過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-124a，能反向調(diào)控其靶基因TGFBR1和BMPR1B 的表達(dá)，證明兩者存在相互作用。同時顯示出Pdx1，Nkx6.1 表達(dá)顯著升高，說明過表達(dá)miR-124a 間接調(diào)控了這些胰腺祖細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，指導(dǎo)了PMSCs 向胰腺祖細(xì)胞的分化。此外，部分細(xì)胞表現(xiàn)出胰島素合成功能，初步證明了PMSCs 轉(zhuǎn)化來的胰腺祖細(xì)胞能夠產(chǎn)生部分功能性β細(xì)胞，并揭示了這可能與TGFβ 通路被抑制導(dǎo)致PMSCs 發(fā)生MET 有關(guān)。有研究顯示，TGFβ 通路在胚胎發(fā)育過程中起重要作用，并與EMT 密切相關(guān)，通過抑制TGFβ 通路能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化［10］。MSCs 向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化必然經(jīng)過MET 的過程，實(shí)驗(yàn)證明MSCs 具有向上皮方向轉(zhuǎn)化的能力［11］。同時，TGFβ 家族成員BMP4 指導(dǎo)細(xì)胞的成骨和成脂分化［12］，通過抑制BMP4 蛋白的作用，抑制MSCs 向成骨和脂肪細(xì)胞的分化，可能也是miR-124a 促進(jìn)PMSCs 發(fā)生胰腺祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原因。本研究通過研究miR-124a 抑制TGFBR1 和BMPR1B 的表達(dá)，達(dá)到了提高PMSCs 向胰腺祖細(xì)胞分化效率，對揭示PMSCs 體內(nèi)的作用機(jī)制以及體外分化獲得大量的功能細(xì)胞，直接參與細(xì)胞和組織重建具有重要意義。

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