板栗抗性淀粉消化前后的益生作用及結(jié)構(gòu)變化

楊春豐，亢靈濤，唐正輝，高 娟，謝 濤

（湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411104）

板栗抗性淀粉消化前后的益生作用及結(jié)構(gòu)變化

楊春豐，亢靈濤，唐正輝，高 娟，謝 濤

（湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411104）

制備與純化得到了板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉，研究了它們的益生作用與結(jié)構(gòu)變化.結(jié)果表明：板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌都有顯著的增殖作用，對(duì)大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌有強(qiáng)抑制作用，對(duì)糞腸球菌、梭狀桿菌、兼性細(xì)菌無明顯影響；它們的發(fā)酵液總酸度增大，說明它們能被腸道益生菌發(fā)酵利用；板栗抗性淀粉經(jīng)消化處理后比表面積增加，經(jīng)發(fā)酵后比表面積更大.板栗抗性淀粉的平均聚合度較之原淀粉顯著變小，發(fā)酵后板栗抗性淀粉或消化抗性淀粉的平均聚合度降低；板栗抗性淀粉的晶型為V型，經(jīng)消化后轉(zhuǎn)變?yōu)锽型，板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，晶型都轉(zhuǎn)變?yōu)锳型，微晶度、亞微晶度及總結(jié)晶度較之發(fā)酵前都明顯降低.

板栗；抗性淀粉；益生作用；結(jié)構(gòu)變化

0 前 言

抗性淀粉（resistant starch）又稱抗酶解淀粉、難消化淀粉，這種淀粉較其他淀粉難降解，在體內(nèi)消化緩慢.抗性淀粉本身仍然是淀粉，其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于纖維，但其性質(zhì)類似溶解性纖維.抗性淀粉的定義為：在小腸中不能被酶解，但在人的腸胃道結(jié)腸中可以與揮發(fā)性脂肪酸起發(fā)酵反應(yīng)的一類淀粉結(jié)構(gòu).淀粉不能被吸收并且能夠進(jìn)入結(jié)腸具有重要的生理功效.早在20世紀(jì)80年代初，國外就開始對(duì)抗性淀粉展開了研究，并認(rèn)為這是一種與膳食纖維功能相似，但口感更優(yōu)的一種新型益生元制劑，其生理功能及加工特征優(yōu)良，具有廣泛的應(yīng)用前景［1，2］.近些年來，國內(nèi)外許多學(xué)者將研究的領(lǐng)域轉(zhuǎn)向了非糧淀粉資源［3，4］，且已有許多關(guān)于抗性淀粉的研究報(bào)道，但主要針對(duì)制備工藝的優(yōu)化［4，5］；而關(guān)于板栗抗性淀粉及其消化抗性淀粉的研究幾無報(bào)道.因此，本文采用二次循環(huán)壓熱法制備并純化得到了板栗抗性淀粉，再經(jīng)人工胃液和人工胃腸液處理制得2個(gè)消化抗性淀粉樣品，然后研究了這3個(gè)樣品的益生作用及其結(jié)構(gòu)變化，以期探討消化前后的抗性淀粉在益生作用過程中可能的結(jié)構(gòu)變化及更多的功能.

1 材料與方法

1.1 材料

選擇性培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（大腸桿菌）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（雙歧桿菌）、LAMVAB瓊脂培養(yǎng)基（乳酸桿菌）、麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基（糞腸球菌）、亞硫酸鹽－環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（梭狀桿菌）、甘露醇瓊脂培養(yǎng)基（產(chǎn)氣莢膜梭菌）、需氧－厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基購自美國Life Tech公司；耐熱α－淀粉酶、糖化酶、胃蛋白酶、胰酶－5.0購自美國Sigma公司；其他試劑均為分析純.

1.2 抗性淀粉的制備與純化

［6］的方法制備和純化得到板栗純抗性淀粉（RS）.

1.3 胃液、胃腸液消化抗性淀粉的制備

按參考文獻(xiàn)［7］的方法制備人工胃液和人工胃腸液消化抗性淀粉，分別簡(jiǎn)稱為DRSAGJ、DRSAGIJ.

1.4 體外厭氧發(fā)酵

1.4.1 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：以2%的板栗抗性淀粉或板栗消化抗性淀粉取代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源.選擇性培養(yǎng)基：見1.1.

1.4.2 厭氧發(fā)酵

參照文獻(xiàn)［7］方法進(jìn)行厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在37℃厭氧培養(yǎng)至10h、20h、30h分別取樣，用于腸道微生物菌群組成和總酸度的測(cè)定分析.

1.4.3 腸道菌群分析

取樣品液1mL，用生理鹽水稀釋一定倍數(shù)后涂布于選擇性平板上，于37℃厭氧培養(yǎng)48～72h后，使用全自動(dòng)菌落分析儀計(jì)數(shù).

1.4.4 發(fā)酵液總酸度測(cè)定

參照GB／T 12456－1990法測(cè)定每份發(fā)酵液的總酸度，并以乳酸含量表示.

1.4.5 發(fā)酵殘余物制備

取10mL發(fā)酵液，離心（15min，3000g），沉淀用10mL蒸餾水清洗三次后烘干，粉碎過100目篩，這些發(fā)酵殘余物分別稱為發(fā)酵抗性淀粉（FRS）、發(fā)酵胃液消化抗性淀粉（FDRSAGJ）和發(fā)酵胃腸液消化抗性淀粉（FDRSAGIJ）.

1.5 結(jié)構(gòu)測(cè)定方法

平均聚合度（DP值）測(cè)定采用碘吸收法［8］；掃描電子顯微（SEM）分析按參考文獻(xiàn)［9］的方法測(cè)定；X－射線衍射（XRD）分析采用參考文獻(xiàn)［10］的方法.

所有數(shù)據(jù)為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值，且采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗抗性淀粉消化前后對(duì)腸道菌群生長的影響

以不添加板栗抗性淀粉或胃腸液消化抗性淀粉為對(duì)照，在10h、20h、30h取樣，測(cè)定板栗抗性淀粉及胃腸液消化抗性淀粉對(duì)腸道菌群生長的影響結(jié)果見表1.從表1可知，發(fā)酵至第30h時(shí)各種腸道微生物菌濃均比發(fā)酵至第20h時(shí)的低，這是可能是30h時(shí)細(xì)菌生長已達(dá)衰老期，導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)目減少.當(dāng)發(fā)酵20h后，板栗抗性淀粉及其胃腸液消化抗性淀粉對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌都有顯著的增殖作用，其中抗性淀粉的增殖效果達(dá)到102倍、消化抗性淀粉的增殖效果更是高達(dá)近104倍左右；對(duì)大腸桿菌、糞腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用也很強(qiáng)；對(duì)梭狀桿菌的影響不明顯.板栗胃腸液消化抗性淀粉比其抗性淀粉對(duì)雙歧桿菌、乳酸桿菌增殖效果更加明顯，對(duì)產(chǎn)氣莢膜菌的抑制作用也更強(qiáng)些，說明抗性淀粉經(jīng)消化道酶及其環(huán)境條件的作用是其發(fā)揮益生作用所必需的，也就是說消化抗性淀粉具有更好的益生作用，這與文獻(xiàn)［11］、［12］報(bào)道的結(jié)果非常一致.

表1 板栗抗性淀粉消化前后對(duì)腸道菌群生長的影響（lg CFU／mL）

2.2 發(fā)酵液的酸度分析

發(fā)酵液的總酸度在一定程度上代表了益生菌尤其是雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖情況，雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖會(huì)促進(jìn)丙酸、丁酸、乳酸等合成［13］.表2為添加不同板栗抗性淀粉和胃腸液消化抗性淀粉發(fā)酵10h、20h、30h所測(cè)得的總酸度（以乳酸值表示）.在整個(gè)發(fā)酵期間，板栗抗性淀粉及其胃腸液消化抗性淀粉的發(fā)酵液總酸度均比對(duì)照值要高出至少20%，說明抗性淀粉及其胃腸液消化抗性淀粉被腸道益生菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸數(shù)量增多，而且后者產(chǎn)生的脂肪酸數(shù)量要多些，這在文獻(xiàn)［14］中也有報(bào)道.

表2 板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵液的總酸度（以乳酸表示，單位g／L））

2.3 發(fā)酵前后板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉的超微結(jié)構(gòu)變化

圖1為發(fā)酵前后板栗抗性淀粉及其消化抗性淀粉的掃描電子顯微照片.由圖1A可看出，經(jīng)壓熱制備的板栗抗性淀粉變?yōu)橛纱笮　⒑癖〔灰坏钠瑢佣逊e而成的疊層結(jié)構(gòu)，且表面粗糙不平.造成這種變化的原因是：在糊化過程中，直鏈淀粉先從原淀粉顆粒中溶出，進(jìn)入水中，冷卻時(shí)，直鏈淀粉分子相互靠近依靠氫鍵及范德華力形成雙螺旋并沉降，形成非常穩(wěn)定的晶體；在后續(xù)純化過程中，粗抗性淀粉中的無定形部分被酶解，剩下高度結(jié)晶的直鏈淀粉.板栗抗性淀粉經(jīng)人工胃液消化后，疊層結(jié)構(gòu)逐漸解體，剝落成大小、厚薄不一且無規(guī)堆積的碎片（圖1B）.板栗抗性淀粉經(jīng)人工胃腸液聯(lián)合作用后，大的碎片進(jìn)一步細(xì)化、厚的碎片變薄，最終變成由大小不一的薄片疏松堆積的結(jié)構(gòu)（圖1C）.發(fā)酵后板栗抗性淀粉由原來單一的疊層結(jié)構(gòu)變?yōu)橛缮倭科瑢优c大量薄片混合堆積的結(jié)構(gòu)，但薄片比例較高（圖1D）.人工胃液消化的抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，厚的碎片與大的薄片消失，變成以較小薄片為主的疏松結(jié)構(gòu)（圖1E）.經(jīng)人工胃腸液消化的抗性淀粉發(fā)酵后，薄片繼續(xù)細(xì)化，最后變成由大小均勻的細(xì)小薄片堆積成的疏松結(jié)構(gòu)（圖1F）.

圖1 發(fā)酵前后板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉的超微結(jié)構(gòu)（放大3000倍）

2.4 發(fā)酵前后抗性淀粉、消化抗性淀粉的平均聚合度變化

圖2為板栗抗性淀粉、消化抗性淀粉發(fā)酵前后的平均聚合度（DP）.板栗抗性淀粉的DP值比其原淀粉的DP值減少了將近一半.這是由于在制備過程中，高溫、高壓使部分直鏈淀粉分子斷裂，支鏈淀粉的部分支鏈斷裂轉(zhuǎn)化為直鏈淀粉，故而抗性淀粉的DP值要比其原淀粉的??；同時(shí)直鏈淀粉分子越大，越容易斷裂.消化后板栗抗性淀粉的DP值比消化前幾無降低，說明消化作用對(duì)抗性淀粉分子的DP值影響很小，而影響的主要是其結(jié)構(gòu).發(fā)酵后板栗抗性淀粉或消化抗性淀粉較之發(fā)酵前的DP值顯著下降，但與抗性淀粉較之原淀粉DP值的降低幅度都要小得多.從圖2還可看出，胃腸液消化過的板栗抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后的DP值比板栗抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后的DP值降低33.3%，由此進(jìn)一步說明胃腸液的消化作用對(duì)抗性淀粉在腸道內(nèi)的益生作用相當(dāng)重要.

圖2 板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵前后的DP值

2.5 發(fā)酵前后抗性淀粉、消化抗性淀粉的結(jié)晶度變化

淀粉是主要由A型和B型晶體及少量V型晶體組成的混合物.圖3是板栗抗性淀粉及其消化抗性淀粉在體外厭氧發(fā)酵前后的X－射線衍射圖譜，由其計(jì)算得到的結(jié)晶參數(shù)如表3所示.板栗抗性淀粉的晶型為V型，說明在制備抗性淀粉的過程中，其分子鏈通過斷裂、重組，形成了更為穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu).板栗抗性淀粉經(jīng)胃液或胃腸液消化后的晶型均轉(zhuǎn)變?yōu)锽型，與抗性淀粉相比，胃液消化抗性淀粉的微晶度、亞微晶度及總結(jié)晶度基本沒有變化，但胃腸液消化抗性淀粉亞微晶度與總結(jié)晶度也有明顯降低，說明經(jīng)過人工胃液的強(qiáng)酸侵蝕與分散作用，增強(qiáng)了人工腸液的消化作用.板栗抗性淀粉及其消化抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，晶型都轉(zhuǎn)變?yōu)锳型，微晶度、亞微晶度及總結(jié)晶度較之發(fā)酵前都明顯降低，說明發(fā)酵作用對(duì)板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)有較大影響.

圖3 板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵前后的X－射線衍射圖譜

表3 板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵前后的結(jié)晶參數(shù)

3 結(jié) 論

（1）板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌都有顯著的增殖作用，對(duì)大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌有強(qiáng)抑制作用，對(duì)糞腸球菌、梭狀桿菌無明顯影響.它們的發(fā)酵液總酸度增大，說明它們被腸道益生菌發(fā)酵利用產(chǎn)生了更多的短鏈脂肪酸.

（2）板栗抗性淀粉經(jīng)人工胃液、胃腸液消化處理后結(jié)構(gòu)越來越疏松，且比表面積增加；板栗抗性淀粉及其消化抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，它們進(jìn)一步碎化為以細(xì)小薄片為主體的有序結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可能具有更大的比表面積和堆積密度，可能與抗性淀粉在腸道中發(fā)揮的其他生理功能有關(guān).

（3）板栗抗性淀粉的DP值較之原淀粉顯著變小.消化后板栗抗性淀粉的DP值比消化前幾無降低，說明胃腸液主要影響抗性淀粉的結(jié)構(gòu).胃腸液消化過的板栗抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后的DP值比板栗抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后的DP值要小.

（4）板栗抗性淀粉的晶型為V型.經(jīng)胃液或胃腸液消化后，板栗抗性淀粉的晶型均轉(zhuǎn)變?yōu)锽型，胃腸液消化抗性淀粉亞微晶度與總結(jié)晶度有所降低.板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，晶型都轉(zhuǎn)變?yōu)锳型，微晶度、亞微晶度及總結(jié)晶度較之發(fā)酵前都明顯降低.

參 考 文 獻(xiàn)

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Probiotic Functions and Structural Changes of Castanea Mollissima Resistant Starch and Its Products After Digestion and Fermentation

YANG Chun－feng， KANG Ling－tao， TANG Zheng－h(huán)ui， GAO Juan， XIE Tao
（College of Chemical Engineering，Hunan Institute of Engineering，Xiangtan 411104，China）

Resistant starches from Castanea mollissima before and after in vitro digestion are made and purified.Their probotic functions and structural changes are intensively studied.The results demonstrate that these resistant starches before and after digestion have good proliferative effect on bifidobacterium and lactobacillus，have inhibitory impact on Escherichia coli and Clostridium perfringens，and have no obious influence on Enterococcus faecalis，Corynebacterium fusifome and facultative bacterial.The increasing total acidities of fermentation liquids demonstrate that these resistant starches before and after digestion can be used by intestinal probiotics.Compared with resistant starch，digested resistant starches have increasing specific surface areas，and have more greater specific surface areas after in vitro anaerobic fermentation.In comparison with native starch，average degree of polymerization of resistant starch decreases significantly.After fermentation，average degree of polymerizations of resistant starches before and after digestion decreases.Crystal type of resistant starch is type V，and then turns into type B after digestion.After fermentation，crystal types of resistant starches before and after digestion all become type A，and the degrees of microcrystalline，submicrocrystal and total crystallinity obviously decreases compared with before fermentation.

castanea mollissima；resistant starch；probotic function；structural change

TS235.2

A

1671－119X（2014）02－0061－05

2014－03－10

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011JJ6009）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（教高司函［2013］8號(hào)）

楊春豐（1992－），男，本科生，研究方向：淀粉化學(xué)與營養(yǎng).

謝 濤（1970－），男，博士，教授，研究方向：再生資源與食品、生物化工.