加標(biāo)回收試驗(yàn)在檢測克倫特羅殘留中的應(yīng)用

丁 丹方友平楊勇敏王有祥黎俊君

1.湖北省十堰市動物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，湖北十堰 442000；2.湖北省十堰市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖北十堰 442000

加標(biāo)回收試驗(yàn)在檢測克倫特羅殘留中的應(yīng)用

丁 丹1方友平2楊勇敏2王有祥2黎俊君1

1.湖北省十堰市動物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，湖北十堰 442000；2.湖北省十堰市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖北十堰 442000

為判定用酶聯(lián)免疫吸附法測定克倫特羅及其殘留的結(jié)果準(zhǔn)確性，筆者對豬尿、豬肝及豬血清中克倫特羅進(jìn)行了檢測及回收試驗(yàn)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用酶聯(lián)免疫吸附法測定克倫特羅及其殘留的實(shí)驗(yàn)室過程處于可控范圍內(nèi)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；但豬肝樣品的處理會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定影響，應(yīng)加以避免。

加標(biāo)回收試驗(yàn)；檢測；克倫特羅；殘留；應(yīng)用

加標(biāo)回收試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室常用的質(zhì)量監(jiān)督和內(nèi)部質(zhì)量控制方法之一，可查找系統(tǒng)誤差的某些來源，其對質(zhì)量控制和檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性有著十分重要的實(shí)踐意義。特別是在克倫特羅及其殘留檢測過程中，由于待檢物資的含量處于痕量或微量水平，加之樣品中不同組分對待檢物質(zhì)的交叉影響等，因此，實(shí)施嚴(yán)格質(zhì)量控制對保證檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠相當(dāng)重要。

克倫特羅屬于β類興奮劑，我國規(guī)定禁止在動物生產(chǎn)中添加使用，但受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，非法添加屢禁不止，中毒事件時有發(fā)生。當(dāng)前全國市、縣級以下實(shí)驗(yàn)室主要采用酶聯(lián)免疫吸附法來檢測豬尿、組織中克倫特羅的殘留。筆者通過試驗(yàn)對豬尿、豬肝及豬血清中克倫特羅檢測的回收試驗(yàn)分析，判定實(shí)驗(yàn)室過程是否處于可控范圍，對判定檢測結(jié)果準(zhǔn)確性有一定的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗(yàn)儀器。Sunrise酶標(biāo)儀 (濾光片波長為450 nm/630 nm），離心機(jī)（3 000～4 000 r/min），微量移液器（10～300 μL，單道、多道），氮吹儀。

2）試驗(yàn)材料。試驗(yàn)用6頭育肥豬所采食飼料中添加5 mg/kg鹽酸克倫特羅，連續(xù)飼喂20 d后停止，休藥期滿20 d時，同時采集豬血清、豬尿及豬肝樣品，對應(yīng)編號。

3）試驗(yàn)試劑。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（購自北京維德維康生物技術(shù)有限公司）、乙酸乙酯（分析純）、異丙醇（分析純）等。

1.2 方 法

1）試樣的制備。豬尿、豬血清：3 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試樣品。豬肝：準(zhǔn)確稱?。?.00±0.01）g樣品，加入6 mL 0.2 mol/L高氯酸溶液；室溫（25℃）下，劇烈渦動2 min，4 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至11.6左右；加入8 mL乙酸乙酯-異丙醇（8∶2）溶液，室溫下劇烈渦動2 min，4 000 r/min離心10 min，取4 mL上層有機(jī)相于新的離心管中，于60℃水浴中，氮?dú)獯蹈?；加?00 μL樣品稀釋液，充分渦動1 min，取上清液作為供試試料。

2）加標(biāo)回收方法。回收試驗(yàn)分為空白加標(biāo)回收和樣品加標(biāo)回收?；厥章适桥卸ǚ治鼋Y(jié)果準(zhǔn)確度的量化指標(biāo)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是衡量結(jié)果精密度的量化指標(biāo)。本試驗(yàn)主要研究ELISA方法測定鹽酸克倫特羅時，平行樣測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、空白加標(biāo)

回收率、實(shí)際樣品加標(biāo)回收率、空白加標(biāo)回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及樣品加標(biāo)回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差5個質(zhì)控指標(biāo)的定量評價標(biāo)準(zhǔn)。

3）加標(biāo)量。加標(biāo)量為檢出限的2～6倍。根據(jù)農(nóng)業(yè)部鹽酸克倫特羅的最低檢測標(biāo)準(zhǔn)1 μL/L標(biāo)準(zhǔn)，豬尿、豬血清試料空白加標(biāo)和實(shí)際樣品加標(biāo)的加標(biāo)量為分別2、4和6 μL/L3個濃度，每個加標(biāo)量濃度作6個平行，同時做6個平行的樣品檢測；豬肝試樣分別在樣品處理前和處理完成后進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)。檢測過程始終在相同的試驗(yàn)條件下進(jìn)行，減少人員、儀器、環(huán)境等條件變化對結(jié)果產(chǎn)生的影響。

4）檢測步驟。按ELISA試劑盒說明書操作。超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品按一定的比例用蒸餾水稀釋后進(jìn)行檢測。

5）回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算。

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）是樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率平均值間的百分比值，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值越小，檢測結(jié)果精密度越高。其計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

豬尿、豬血清加標(biāo)回收率見表1，樣品中克倫特羅含量見表2，豬肝加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表3，空白加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表2 豬尿、豬血清的檢測結(jié)果

表3 豬肝加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表4 空白加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

1）由表1和表2可知，不同樣品中添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)回收率為60.2%～100.5%，在試劑盒規(guī)定的回收率范圍（60%～120%）內(nèi)；精密度均在相同的范圍內(nèi)，表明檢測結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)得到了有效控制。

2）由表3可知，樣品處理前加標(biāo)回收率為60.2%～79.6%，樣品處理后加標(biāo)回收率為85.6%～95.6%，樣

品處理后加標(biāo)回收率明顯高于樣品處理前的加標(biāo)回收率。表明樣品處理過程對試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性產(chǎn)生很大的影響，試驗(yàn)時應(yīng)考慮樣品處理過程中對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素。

表1 豬尿、豬血清加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3）由表2和表4可知，試樣及空白加標(biāo)重復(fù)測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5%，說明檢測操作過程對測定結(jié)果的影響相對較小，在試驗(yàn)誤差允許范圍內(nèi)。

3 討論

1）加標(biāo)回收率反映了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差反映了檢測結(jié)果的精密度，可有效的運(yùn)用到克倫特羅藥物殘留的檢測中，對試驗(yàn)分析的準(zhǔn)確度有著較好的監(jiān)控作用，能夠及時發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)過程中存在的問題是由于系統(tǒng)誤差產(chǎn)生還是偶然誤差產(chǎn)生的，并提出改進(jìn)的方法，有效提高檢測人員的技術(shù)水平。

2）由試驗(yàn)結(jié)果可知，向含有克倫特羅的豬尿、豬血清添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，回收率和空白添加回收率基本相同，因此，設(shè)計(jì)回收試驗(yàn)時，可直接用空白加標(biāo)回收作為質(zhì)量控制的手段之一。豬肝樣品需進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理程序，設(shè)計(jì)回收試驗(yàn)時，最好在樣品處理前添加克倫特羅，以便能及時發(fā)現(xiàn)影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，采取有效措施加以改正。

3）在檢測過程中應(yīng)控制好試驗(yàn)條件，避免影響試驗(yàn)結(jié)果的各種因素（如人員、儀器、環(huán)境、檢測方法等）發(fā)生變化。應(yīng)合理設(shè)計(jì)回收試驗(yàn)，評價試驗(yàn)結(jié)果的可信度，對發(fā)現(xiàn)結(jié)果存在較大偏移的，應(yīng)立即采取有效措施，取得滿意的結(jié)果。

4）加標(biāo)回收試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控手段的一種，具有簡單、易操作等特點(diǎn)，特別適合于樣本數(shù)量大的檢測，但在實(shí)際檢測工作中需要結(jié)合其他質(zhì)控方法，對實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果實(shí)施全面質(zhì)量控制。

蛋雞養(yǎng)殖如何巧省料

1）保證充足的飲水。雞每產(chǎn)一枚雞蛋需要消耗340 mL水，若在產(chǎn)蛋時缺水，可使產(chǎn)蛋量下降30%。

2）淘汰低產(chǎn)母雞。雞群中常有10%～30%的低產(chǎn)雞，把低產(chǎn)雞淘汰掉，雞群的產(chǎn)蛋量不會明顯減少，但可以大大節(jié)省飼料。

3）把好飼料關(guān)。不喂發(fā)霉變質(zhì)的飼料，保證飼料的全價營養(yǎng)飼料；粉碎不能過細(xì)，否則易造成采食困難且“料塵”飛揚(yáng)而浪費(fèi)。

4）使用替代料。蛋白質(zhì)飼料尤其是魚粉的價格較高，用一些廉價的昆蟲、蚯蚓、當(dāng)?shù)氐男◆~蝦、肉類加工的副產(chǎn)品、魚的下腳料、粉渣、糖渣、豆腐渣、酒糟等，經(jīng)適當(dāng)加工調(diào)制后替代部分蛋白質(zhì)飼料喂雞，可大大降低飼料成本。

5）添喂桿菌肽鋅。夏季在雞日糧中添加100～150 mg/kg桿菌肽鋅，可使產(chǎn)蛋量提高20%，飼料轉(zhuǎn)化率提高10%，蛋殼厚度也明顯增加。

6）添喂蛋氨酸。在一般飼料中添加0.1%的蛋氨酸，可使飼料蛋白質(zhì)的利用率提高2%～3%。

7）添喂維生素C。在每噸雞飼料中添加50 g維生素C，可使產(chǎn)蛋率提高10%以上，節(jié)省飼料15%以上。

8）添喂沙礫。每周適量補(bǔ)喂1次沙礫，有助于肌胃中飼料的研磨，幫助消化和吸收，使飼料消化率提高3%～8%。

9）添喂麥飯石。在蛋雞日糧中加入2%的麥飯石粉，可提高產(chǎn)蛋率8.43%，降低死亡率1.11%，每產(chǎn)1 kg蛋節(jié)料46 g。

10）添喂蒼耳餅。蒼耳餅是蒼耳果實(shí)榨油脂后的副產(chǎn)品，含粗蛋白質(zhì)39%及微量鎮(zhèn)靜物質(zhì)，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中加入10%的蒼耳餅粉，可使產(chǎn)蛋率提高8.35%，蛋重提高2.8%，飼料報酬提高4.7%。

11）改進(jìn)料槽結(jié)構(gòu)。喂雞的料槽應(yīng)該是底尖、肚大、口小，因?yàn)檫@樣的料槽容料多，雞也不容易把飼料啄出來，使雞能吃凈剩料。至于料槽高度，應(yīng)以雞能自由采食為主要準(zhǔn)則。料槽添料量不宜過滿，一般掌握在1/3槽高，否則易拋撒、浪費(fèi)。據(jù)報道，飼料添加到料槽的2/3時飼料浪費(fèi)12%，加到1/2時浪費(fèi)5%，加到1/3時浪費(fèi)2%。

來源：中國禽病網(wǎng)

2014-03-04

楊勇敏

丁 丹，女，1977年生，碩士，獸醫(yī)師。