細(xì)胞制備實(shí)驗室沉降菌檢測分析

馬學(xué)斌，馬 聰，邱 偉，袁紅霞

細(xì)胞制備實(shí)驗室沉降菌檢測分析

馬學(xué)斌，馬 聰，邱 偉，袁紅霞

目的：系統(tǒng)開展細(xì)胞制備實(shí)驗室沉降菌動態(tài)監(jiān)測，保障實(shí)驗室環(huán)境安全，為類似實(shí)驗室消毒監(jiān)測提供資料。方法：根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》的要求，對萬級潔凈區(qū)的空氣用平皿沉降菌法檢測菌落并計數(shù)，對潔凈服及操作人員的手用涂布平皿法檢測菌落并計數(shù)，將2012年9月至2013年10月間的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果：共進(jìn)行空氣沉降菌檢測52次，平均菌落數(shù)為：百級超凈臺和4℃冰箱為0.01 cfu/皿，CO2培養(yǎng)箱為0 cfu/皿，萬級潔凈區(qū)為0.04～0.12 cfu/皿；潔凈服及操作人員的手檢測14次，實(shí)驗前檢測結(jié)果均為陰性，實(shí)驗后偶有菌落檢出，所有檢測結(jié)果全部低于標(biāo)準(zhǔn)要求。結(jié)論：生物治療實(shí)驗室的沉降菌檢測結(jié)果遠(yuǎn)低于藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的要求，可以為生物治療用細(xì)胞制備提供安全的環(huán)境。

細(xì)胞制備實(shí)驗室；沉降菌；監(jiān)測

0 引言

近年來，過繼免疫細(xì)胞治療在惡性腫瘤治療方面取得的顯著效果和展示的巨大潛力得到了全球科學(xué)界的認(rèn)同，已經(jīng)成為腫瘤治療的重要研究方向。個體化免疫細(xì)胞的成功制備是免疫治療的重要基礎(chǔ)。如何保證細(xì)胞制備實(shí)驗室的安全和細(xì)胞制品的安全是該項研究的重中之重。目前，對于細(xì)胞制備實(shí)驗室尚無針對性的標(biāo)準(zhǔn)化管理規(guī)范，如何做好細(xì)胞制備實(shí)驗室的無菌工作，是所有研究者都在關(guān)注的問題。筆者將所在實(shí)驗室的清潔消毒程序和沉降菌檢測工作進(jìn)行匯總分析，希望能為相關(guān)實(shí)驗室的無菌工作和實(shí)驗室管理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司3100恒溫CO2培養(yǎng)箱），直徑90mm一次性無菌空氣培養(yǎng)皿（本院檢驗科細(xì)菌室自制，無菌檢測后發(fā)放），海爾4℃冷藏箱。

1.2 方法

1.2.1 檢測對象

細(xì)胞制備實(shí)驗室百級潔凈工作臺、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、萬級潔凈細(xì)胞培養(yǎng)間、萬級潔凈內(nèi)走廊、萬級二更衣區(qū)、潔凈服上衣、潔凈服褲子、操作人員的手內(nèi)彎側(cè)。

1.2.2 檢測依據(jù)

參照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》、GB/T 16249—1996《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》[1]和《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》[2]的具體方法和要求進(jìn)行檢測。

1.2.3 潔凈區(qū)域空氣沉降菌的采樣檢測沉降菌的具體檢測標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 潔凈區(qū)沉降菌檢測標(biāo)準(zhǔn)（平均菌落數(shù)：cfu/皿）

生物治療實(shí)驗室各區(qū)域分布及面積分別為：萬級細(xì)胞制備室4間，其中A1房間20m2，A2房間25.7m2，A3房間25.8m2，A4房間47.2m2；內(nèi)走廊33.7m2；二更衣室5.3m2。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置實(shí)際采樣點(diǎn)位置及數(shù)目見表2。

表2 空氣沉降菌采樣點(diǎn)及沉降碟數(shù)

生物治療實(shí)驗室按照管理規(guī)定進(jìn)行清潔滅菌：每班工作前后用75%酒精清潔工作臺面并紫外線照射30min，當(dāng)天工作結(jié)束后用 500 mg/L健之素溶液拖擦地面；每周大清潔一次，用滅菌水和酒精擦拭儀器內(nèi)外表面、墻面、天花板，用500mg/L健之素溶液拖擦地面，之后用臭氧（5～15 g/m3）消毒60min；每個月用過氧乙酸（1.8 g/m3）熏蒸2 h。沉降菌檢測在每周大清潔之后第二天進(jìn)行。

1.2.4 潔凈服及操作人員手的采樣檢測

潔凈服的細(xì)菌檢測和工作人員手的細(xì)菌檢測每月進(jìn)行一次抽檢。抽取消毒滅菌的潔凈服2套，取手臂和褲腿部位在空氣培養(yǎng)皿的表面輕輕按壓后，蓋上培養(yǎng)皿的蓋子放入37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。工作人員的手的檢測，在工作人員按流程更換刷手衣褲和潔凈服，穿戴口罩、手套并消毒后進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)間開始常規(guī)工作前和工作中分別進(jìn)行2次采樣檢測，用手彎側(cè)內(nèi)指面在培養(yǎng)皿上按壓后，蓋上培養(yǎng)皿的蓋子放入37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2012年9月至2013年10月間空氣沉降菌每周檢測一次，潔凈服和操作人員的手每月檢測一次。其中，檢測超凈工作臺52次，CO2培養(yǎng)箱52次，潔凈區(qū)各區(qū)域空氣培養(yǎng)52次，潔凈服檢測14次，工作人員的手在工作前和工作中各檢測14次。

2.1 潔凈區(qū)空氣沉降菌檢測結(jié)果

所有空氣沉降菌檢測的溫度和濕度在規(guī)定范圍內(nèi)，每次檢測人數(shù)不超過2人，布點(diǎn)位置離地0.8～1.5m，按照規(guī)定位置單線路從內(nèi)到外依次放置，打開培養(yǎng)皿蓋暴露在空氣中30min，再按反方向?qū)⑴囵B(yǎng)皿蓋全部蓋上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察菌落的生長情況。菌落計數(shù)：用肉眼仔細(xì)觀察，然后計算平均菌落數(shù)/皿。計算公式為：平均菌落數(shù)/皿=單個培養(yǎng)皿菌落數(shù)之和/培養(yǎng)皿總數(shù)。

每次檢測結(jié)果全部合格，所有檢測結(jié)果統(tǒng)計見表3。本實(shí)驗室的萬級潔凈區(qū)域沉降菌檢測結(jié)果完全滿足GMP標(biāo)準(zhǔn)要求的＜2 cfu/皿（30min，90mm），百級超凈工作臺檢測結(jié)果滿足藥品生產(chǎn)管理規(guī)范（goodmanufacturing practice，GMP）要求的＜1 cfu/皿（30 min，90 mm），可以用于免疫細(xì)胞的培養(yǎng)。

表3 2012年9月至2013年10月空氣沉降菌檢測結(jié)果

2.2 潔凈服及操作人員手內(nèi)側(cè)的檢測結(jié)果

潔凈服和刷手衣是本院消毒供應(yīng)室統(tǒng)一高壓消毒滅菌后領(lǐng)取使用的。工作人員在洗手和手消毒后進(jìn)入一更衣室更換刷手衣，進(jìn)入二更衣室再次手消毒，然后按順序穿戴無菌口罩、潔凈服、無菌手套，再次手消毒后，通過2個緩沖區(qū)和內(nèi)走廊進(jìn)入細(xì)胞制備間。潔凈服的檢測是在打開包裝時取上衣和下衣分別在空氣培養(yǎng)皿上輕按，盡量布滿整個培養(yǎng)皿，然后蓋上蓋子，放入37℃培養(yǎng)箱檢測。工作人員手的檢測是在工作前和工作中，用戴手套的手內(nèi)彎側(cè)在培養(yǎng)皿表面輕按，盡量布滿整個培養(yǎng)皿，然后蓋上蓋子，放入37℃培養(yǎng)箱檢測，48 h后觀察結(jié)果。

工作前所有檢測結(jié)果均為陰性，工作中偶有細(xì)菌檢出。該結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GMP標(biāo)準(zhǔn)要求的＜1 cfu/皿，完全滿足GMP實(shí)驗室的要求，見表4。

表4 2012年9月至2013年10月潔凈服及手檢測結(jié)果

3 討論

隨著我國藥品GMP制度的發(fā)展，對藥品生產(chǎn)中潔凈室的控制要求越來越高。生物治療用細(xì)胞屬于特殊藥品的范圍，它取材于患者自身的外周血，通過實(shí)驗室一段時間的誘導(dǎo)激活而使細(xì)胞活力和數(shù)量有一個顯著擴(kuò)增，然后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)達(dá)到疾病治療的目的。一般藥品可以大批量規(guī)?；a(chǎn)，單一批次和生產(chǎn)結(jié)束后車間可以進(jìn)行清潔消毒；而免疫細(xì)胞的制備由于個體化多批次進(jìn)行，很難停止細(xì)胞的制備來進(jìn)行清潔消毒。同時，相對于批量化的藥品生產(chǎn)方式，這種個體化的細(xì)胞制備方式因為取材于患者，具有原料來源的不可替代性和重復(fù)生產(chǎn)的不可復(fù)制性，一旦培養(yǎng)失敗或者細(xì)胞污染將會造成很嚴(yán)重的后果，不僅不能完成細(xì)胞制品的成功制備，還會使患者后續(xù)的治療受到嚴(yán)重影響。因此，細(xì)胞制備實(shí)驗室的無菌要求比一般的潔凈生產(chǎn)車間更高、更嚴(yán)苛，如何持續(xù)保證其無菌狀態(tài)是一個重要的問題。

目前，在細(xì)胞制備實(shí)驗室的設(shè)計、建設(shè)和管理方面，由于沒有專門針對細(xì)胞制備實(shí)驗室的設(shè)計規(guī)范，只能參照現(xiàn)行的《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計規(guī)范》和《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》進(jìn)行設(shè)計，并套用相關(guān)的規(guī)則。然而，由于細(xì)胞制品的特殊性，所有細(xì)胞制備的細(xì)胞均來源于患者的血液或者骨髓等組織，這些前體細(xì)胞均可能攜帶潛在的生物危害（如肝炎病毒等），因此，在嚴(yán)格遵循上述規(guī)范基本原則的前提下，需要充分考慮細(xì)胞制備個體化、防止交叉污染、保護(hù)操作人員安全性等核心環(huán)節(jié)[3]。在這個前提下，本實(shí)驗室研究制定了嚴(yán)格的人員、物品進(jìn)出實(shí)驗室的流程和嚴(yán)格的人員、物品和環(huán)境清潔消毒管理制度及及時的檢測規(guī)定，保證了細(xì)胞制品和人員的雙重安全。

細(xì)胞制備實(shí)驗室的潔凈安全性包括很多因素，基本前提是空調(diào)凈化系統(tǒng)的建立。整個系統(tǒng)的塵粒90%來源于新風(fēng)，而塵粒是很多細(xì)菌的攜帶者，所以，新風(fēng)處理是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[4]。本實(shí)驗室新風(fēng)機(jī)組采用袋式初效過濾器和袋式中效過濾器2套過濾裝置，分別可以過濾掉40%～80%的直徑大于5μm的顆粒和70%的直徑大于1μm的顆粒；過濾后的新風(fēng)進(jìn)入循環(huán)機(jī)組，通過板式初效過濾器再次過濾掉40%～80%的直徑大于5μm的顆粒，此時新風(fēng)與機(jī)組循環(huán)風(fēng)共同通過循環(huán)機(jī)組中的袋式中效過濾器，在此過濾掉大約70%的直徑大于1μm的顆粒。最后，新風(fēng)和循環(huán)風(fēng)共同到達(dá)位于房間頂部的高效過濾器，在此過濾掉直徑大于0.5μm的顆粒，過濾效率可以達(dá)到99.999 5%。這樣經(jīng)過2級的新風(fēng)過濾和3級的循環(huán)機(jī)組空氣過濾，最后到達(dá)細(xì)胞制備間的是潔凈度相對較高的空氣。

在細(xì)胞制備實(shí)驗室潔凈度不同的區(qū)域，應(yīng)當(dāng)保持一定的靜壓差，保證潔凈度較高的區(qū)域的室內(nèi)壓力高于潔凈度相對較低的區(qū)域。按照GMP最新版的要求，靜壓差不能低于10 Pa。這樣可以保證氣流的流向，從而保證細(xì)胞制備實(shí)驗室核心區(qū)域的潔凈度[5]。靜壓差的維持主要是通過各級空氣過濾器和對換氣次數(shù)的控制來實(shí)現(xiàn)的，如果過濾器阻力變大，則會使壓差減小。因此，對壓差的監(jiān)測和對過濾器的日常維護(hù)保養(yǎng)也是一個重要的內(nèi)容[6]。

過濾不等于消毒。據(jù)統(tǒng)計，一個靜止不動的人每分鐘能夠散發(fā)出100 000個帶有細(xì)菌的粒子[7]，這些粒子的平均直徑在2～10μm之間，由于重力原因這些粒子很容易降落在室內(nèi)物品的表面上。因此，本實(shí)驗室對于工作人員的著裝具有嚴(yán)格的要求：內(nèi)著刷手衣，外著連帽連襪的潔凈服，戴無菌口罩和手套，盡量減少身體部位的暴露。在操作中，每次手移出超凈工作臺百級潔凈區(qū)域后，再次進(jìn)入都需要噴灑酒精消毒。同時嚴(yán)格執(zhí)行每次實(shí)驗后對操作臺面、實(shí)驗桌面進(jìn)行酒精擦拭消毒，每日工作完成后用500mg/L的含氯消毒液拖擦地面。本項研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，工作前的潔凈服和手的檢測都是全部無菌的，而工作中會有菌落的檢出，這說明工作的過程就是一個發(fā)塵污染的過程。因此，工作過程中的手消毒是非常必要和不可或缺的，工作后的清潔是保證次日工作質(zhì)量的重要程序。

空氣消毒滅菌有多種方法[8]。紫外線滅菌屬于電磁波輻射，其穿透能力差，殺菌能力隨使用時間的增加而減少，但較易穿透清潔空氣，故廣泛應(yīng)用于空氣滅菌和表面消毒，使用方法簡便易行，是目前實(shí)驗室常規(guī)使用的方法。臭氧是一種廣譜殺菌劑，具有強(qiáng)烈的殺菌消毒作用，且可以彌散到各個角落，使殺菌沒有死角，與微生物細(xì)胞中多種成分產(chǎn)生反應(yīng)，形成不可逆的變化而死亡，有效殺菌濃度為20mg/m3，30min對自然菌的殺滅率達(dá)到90%以上。臭氧容易分解，一般30min可以完全分解為氧氣，對空氣污染小。過氧乙酸的殺菌作用是基于強(qiáng)大的氧化能力，對細(xì)菌繁殖體、芽孢、真菌、病毒都有高效的殺滅作用，用于潔凈實(shí)驗室消毒的熏蒸濃度為1.8 g/m3，但是對金屬器皿具有一定的腐蝕性。以上消毒滅菌方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，本實(shí)驗室使用多種消毒滅菌方法可以起到互補(bǔ)的作用，在1 a多的檢測中始終保持了較低的沉降菌檢出結(jié)果。

本實(shí)驗室在加強(qiáng)管理和消毒制度規(guī)范下，嚴(yán)格按照流程進(jìn)行細(xì)胞制備實(shí)驗室的清潔消毒、維護(hù)和記錄，這1 a來的記錄結(jié)果顯示滅菌效果良好，所有檢測結(jié)果均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，無一例細(xì)胞污染等不良事件的發(fā)生，為生物治療用細(xì)胞的制備提供了安全的環(huán)境。希望本實(shí)驗的經(jīng)驗可以為類似的實(shí)驗室在工作中提供借鑒。

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[1]GB/T 16249—1996 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1996.

[2]中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部.中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2002.

[3]馬東初，于卉影，陳偉，等.自體CIK治療技術(shù)細(xì)胞制品制備面臨的問題與持續(xù)改進(jìn)的思考[J].醫(yī)學(xué)爭鳴，2013，4（3）：27-30.

[4]李在秋，郭亞東，苑慶忠，等.某動物房潔凈空調(diào)系統(tǒng)氣流組織研究[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2013，34（6）：23-25.

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[7]孫亞楠，王威.潔凈手術(shù)室建設(shè)與運(yùn)行管理[J].中國醫(yī)院建筑與裝備，2011（10）：78-81.

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（收稿：2013-11-12 修回：2014-01-06）

Settlement bacteriamonitoring and analysis in cell preparation lab

MA Xue-bin1,MA Cong2,QIUWei1,YUAN Hong-xia1
(1.Center for Tumor Diagnosis and Treatment,Naval General Hospital,Beijing 100048,China; 2.Departmentof Clinical Laboratory,Naval General Hospital,Beijing 100048,China)

Objective To carry out dynamic monitoring of the settlement bacteria in the cell preparation lab to ensure lab environment safety,and to provide references to other likely labs.Methods Based on Good Manufacturing Practice(edited in 2010),plate settlement bacteriamethod was used to detect and calculate the bacterial colony in the air of 10,000 grade clean area,and spread plate settlement bacteria method was applied to the detection and calculation of the bacterial colony in the clean clothing and hands of the operator.Then statistical analysis was performed for the detection results from September 2012 to October 2013.Results Totally 52 times of air settlement bacteria detection were implemented, which counted themean bacteria colony as 0.01 cfu per plate in 100 grade super clean bench and 4℃refrigerator,0 cfu per plate in CO2incubator and 0.04 to 0.12 cfu per plate in 10,000 grade clean area.There were 14 times of detection for clean clothing and the hands of the operator occurred,which all had negative results before detection.Bacteria could be found occasionally in the clean clothing and the hands of the operator,with all the detection results lower than the desired requirements of the standard.Conclusion The settlement bacteria results in the cell preparation lab are far low from the request of Good Manufacturing Practice (edited in 2010),which can provide qualified environment in cell preparation for the biological treatment.[Chinese Medical Equipment Journal，2014，35（7）：21-23，30]

cell preparation lab;settlementbacteria;monitoring

R318；TU411

A

1003-8868（2014）07-0021-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2014.07.021

馬學(xué)斌（1971—），女，碩士，主管技師，主要從事腫瘤生物治療方面的研究工作，E-mail：1965394316@qq.com。

100048北京，海軍總醫(yī)院腫瘤診療中心（馬學(xué)斌，邱 偉，袁紅霞），檢驗科（馬 聰）

馬 聰，E-mail：macong66958166@163.com