兔門靜脈種植VX2癌栓CT灌注參數(shù)與血管內皮生長因子的相關性

魏 強 WEI Qiang

雷 振 LEI Zhen

馮國全 FENG Guoquan

楊 旭 YANG Xu

兔門靜脈種植VX2癌栓CT灌注參數(shù)與血管內皮生長因子的相關性

魏 強 WEI Qiang

雷 振 LEI Zhen

馮國全 FENG Guoquan

楊 旭 YANG Xu

目的建立兔VX2腫瘤模型，采用多層螺旋CT（MSCT）灌注成像技術探討兔門靜脈VX2種植癌栓灌注參數(shù)與血管內皮生長因子（VEGF）表達的相關性。材料與方法8只實驗兔經(jīng)門靜脈內接種VX2腫瘤，成瘤后行MSCT灌注掃描，測量并比較門靜脈癌栓、近瘤灶和遠離瘤灶肝臟的肝血流灌注量（HBF）、肝血容積（HBV）、毛細血管表面通透性（PS）及平均通過時間（MTT）；摘取門靜脈移植VX2癌栓，采用免疫組化檢測癌栓組織VEGF表達，分析肝臟灌注參數(shù)與VEGF的相關性。結果近瘤灶和遠離瘤灶肝臟各CT灌注參數(shù)間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；門靜脈癌栓區(qū)HBF、HBV及PS均較近瘤灶區(qū)和遠離瘤灶區(qū)增高（P＜0.05），MTT較近瘤灶區(qū)和遠離瘤灶區(qū)降低（P＜0.05）。門靜脈VX2種植癌栓區(qū)HBF、HBV、PS與VEGF表達均呈正相關（r=0.711、0.646、0.626, P＜0.05），MTT與VEGF表達呈負相關（r=－0.565, P＜0.05）。結論兔門靜脈VX2種植癌栓 MSCT灌注參數(shù)與VEGF表達具有相關性，MSCT能夠評價門靜脈種植VX2癌栓的血管生成。

肝腫瘤，實驗性；VX2腫瘤；門靜脈；體層攝影術，螺旋計算機；灌注成像；血流動力學；血管內皮生長因子類；疾病模型，動物；兔

原發(fā)性肝細胞癌伴門靜脈癌栓形成可導致肝內外播散和門靜脈高壓[1]。癌栓內的微血管生成是癌栓生長、浸潤和轉移的一個重要因素。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是最有效的促血管生長因子，癌細胞的生長及轉移依賴新生血管的形成[2,3]。免疫組化檢測VEGF可以評價腫瘤血管生成，但其結果滯后，且為有創(chuàng)性檢查；超聲、MRI、 CT等均不能在腫瘤發(fā)生形態(tài)學改變之前檢測到其功能變化。目前，肝癌患者門靜脈癌栓的多層螺旋CT（MSCT）灌注參數(shù)與其VEGF表達相關性的臨床及動物實驗研究鮮有報道，建立肝癌伴門靜脈癌栓的動物模型，是研究癌栓的病理機制和臨床治療的實驗基礎。本研究擬通過對兔門靜脈VX2種植瘤行MSCT灌注成像，分析門靜脈癌栓新生血管CT灌注參數(shù)的變化及其與VEGF表達的相關性，為肝癌患者門靜脈癌栓的臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 日本大耳白兔9只，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供（合格證號SCXK遼2009-0004），雌雄不限，體重2.5～3.0 kg。實驗兔于兔籠中飼養(yǎng)，給予植物性能量顆粒飼料及清潔飲水。本實驗研究經(jīng)遼寧醫(yī)學院倫理委員會審核批準。

1.2 VX2瘤株的制備 將VX2瘤株凍存塊解凍復蘇，制備瘤細胞懸液。取1只用于傳代腫瘤接種，接種于兔后肢內側肌肉內，使之成瘤。約15 d后接種處可捫及一實質性包塊。將兔全麻后于無菌條件下剝離腫瘤，切取包塊邊緣生長旺盛的魚肉樣組織，剔除壞死組織及纖維組織，將瘤組織剪切至大小約1.2 mm×1.2 mm×5.0 mm的小塊瘤條，用生理鹽水反復沖洗，置于盛有20 ml RPMI 1640培養(yǎng)液的玻璃皿中。采用1 ml注射器連接14 G針頭抽取已經(jīng)準備好的瘤株備用。

1.3 兔門靜脈種植VX2癌栓模型制作 選取8只實驗兔，經(jīng)鹽酸賽拉嗪注射液0.1 ml/kg全麻后，常規(guī)消毒，于上腹部劍突下作一長約5.0 cm切口，進入腹腔尋找到腸系膜上靜脈，用準備好的注射器將腫瘤株快速注入腸系膜上靜脈內，拔針后即用明膠海綿條按壓穿刺處約1 min，充分止血后將肝臟回納至腹腔，以生理鹽水沖洗后在腹腔內噴撒白霉素，逐層縫合關閉腹腔，術后經(jīng)耳緣靜脈滴注白霉素0.1 g，1次/d，連續(xù)滴注3 d。

1.4 MSCT檢查 瘤株接種2周后，8只荷瘤兔采用GE LightSpeed 16層CT機進行增強掃描，證實門靜脈癌栓形成，并將造模成功的實驗兔行MSCT灌注掃描。實驗兔先行CT平掃，掃描參數(shù)：電壓80 kV，電流120 mAs，矩陣512×512，視野12～16 cm，層厚2.5 mm。觀察癌栓生長情況，選取癌栓最大層面的相鄰4層為灌注層面。緩慢推注氯化琥珀膽堿1 mg/kg，待呼吸抑制時，采用MSCT的多層同層 動 態(tài)CT灌 注 掃 描（“Toggling table” 技 術 ）進行4層同層灌注掃描。同時采用高壓注射器經(jīng)耳緣靜脈注射對比劑碘海醇（350 mgI/ml）1.0 ml/kg，注射速度0.5 ml/s，延遲5 s開始CT灌注掃描，采用電影模式采集圖像，掃描50 s；灌注掃描參數(shù)：層厚5 mm/4i，重建層厚1.0 mm/2i，4排探測器連續(xù)掃描，機架旋轉1周床移3.75 mm，螺距比1.375，掃描架無傾斜，管電壓80 kV，管電流130 mAs，矩陣512×512，視野12～16 cm。

數(shù)據(jù)傳至ADW 4.2工作站，采用GE Perfusion 3中的體部腫瘤灌注軟件進行數(shù)據(jù)處理，以腹主動脈為輸入動脈，門靜脈主干或分支為輸入靜脈，經(jīng)計算機處理生成時間-密度曲線（TDC）。每一層面選取3～5個感興趣區(qū)（ROI），每個ROI大小3～5 mm2，每只實驗兔至少測量2個層面，測量門靜脈種植癌栓區(qū)的灌注參數(shù)，包括肝血流灌注量（hepatic blood fow, HBF）、肝血容積（hepatic blood volume, HBV）、毛細血管表面通透性（probability of surface area product, PS）及平均通過時間（mean transit time, MTT）。

1.5 免疫組化檢查 掃描結束后，實驗兔于全麻下摘取門靜脈移植VX2瘤栓。瘤組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，行HE染色，并采用SP法測定VEGF表達。

1.6 VEGF表達判斷標準 采用半定量積分法[4]，按照染色強度及陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)的百分比綜合積分。參照劉佩芳等[5]和李杰等[6]的半定量方法，于400倍光鏡下觀察，腫瘤細胞胞質中見著色深淺不一的棕色或棕黃色顆粒即為VEGF表達陽性細胞，每張切片隨機選取有VEGF表達的5個視野判斷VEGF的表達程度，先根據(jù)染色強度打分：0分，無色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。然后根據(jù)陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)的百分比打分：0分，無陽性細胞；1分，陽性細胞＜10%；2分，陽性細胞10%～50%；3分，陽性細胞51%～70%；4分，陽性細胞＞70%。以染色強度和陽性細胞百分比積分的乘積判斷腫瘤細胞VEGF表達水平：0分，陰性；＜3分，弱陽性；≥3分，強陽性。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件，門靜脈癌栓、近瘤灶肝臟、遠離瘤灶肝臟HBF、HBV、MTT、PS比較采用成組t檢驗，門靜脈癌栓區(qū)HBF、HBV、MTT、PS與VEGF表達的相關性采用Spearman等級相關分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤接種情況 8只實驗兔接種VX2瘤株，均成功制作VX2癌栓模型，腫瘤接種成活率達100%。8只實驗兔于接種部位均有腫瘤生長，均納入本實驗。

2.2 增強CT及灌注掃描結果 8只實驗兔完成MSCT灌注掃描，CT增強掃描示門靜脈區(qū)充盈缺損（圖1A），灌注掃描顯示，與正常肝組織灌注參數(shù)不同，門靜脈種植癌栓區(qū)及周圍肝組織灌注參數(shù)呈“熱區(qū)”（圖1B～E），瘤區(qū)的HBF、HBV及PS均高于周圍肝組織，使用灌注軟件獲得對比劑灌注后50 s內的TDC圖（圖1F），MTT降低表明兔門靜脈VX2種植癌組織灌注參數(shù)高于周圍肝組織。分別于實驗兔門靜脈癌栓區(qū)、近瘤灶和遠離瘤灶肝臟組織進行灌注參數(shù)測量，取平均值作為最終結果。

2.3 兔門靜脈種植VX2癌栓與正常肝組織CT灌注參數(shù)比較 門靜脈癌栓區(qū)HBF、HBV及PS較近瘤灶區(qū)和遠離瘤灶區(qū)增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MTT降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；近瘤灶區(qū)與遠離瘤灶區(qū)肝臟HBF、HBV、PS及MTT比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1及圖1B～E。

表1 門靜脈癌栓區(qū)、近瘤灶區(qū)和遠離瘤灶區(qū)肝臟CT灌注參數(shù)比較（n=8）

圖1 CT增強掃描顯示兔門靜脈區(qū)充盈缺損（箭），證明癌栓形成，動物模型制作成功（A）；灌注HBF圖顯示門靜脈癌栓區(qū)血流狀態(tài)（綠色）高于正常肝組織（藍色，B）；灌注HBV圖顯示門靜脈癌栓區(qū)血流灌注狀態(tài)（紅色）高于正常肝組織（綠色，C）；灌注MTT圖顯示門靜脈癌栓區(qū)灌注MTT（紅色）較肝組織（橙色）縮短（D）；灌注PS圖顯示門靜脈癌栓區(qū)滲透狀態(tài)（綠色）高于正常肝組織（藍色，E）；TDC圖顯示腹主動脈TDC（1）、兔門靜脈種植癌栓組織TDC（2）及遠瘤灶肝組織TDC（3），2的峰值高于3，表明兔門靜脈VX2種植癌栓組織灌注高于肝組織（F）

2.4 兔門靜脈種植VX2癌栓的VEGF表達結果 VEGF陽性染色顆粒主要存在于腫瘤細胞胞質和包膜內（圖2）。門靜脈VX2種植組8只實驗兔癌栓VEGF陽性表達積分分別為2分、6分、6分、8分、8分、9分、9分、12分，以門靜脈VX2瘤栓種植組VEGF表達程度代表實驗組VEGF表達程度。

圖2 腫瘤組織VEGF表達。免疫組化染色示腫瘤細胞胞質內見棕褐色顆粒（箭），胞質較少，核大深染，異形性明顯（SP法，×400）

2.5 兔門靜脈種植VX2癌栓CT灌注參數(shù)與VEGF表達的相關性 兔門靜脈種植VX2癌栓HBF、HBV及PS與癌栓的VEGF表達均呈正相關（r=0.711、0.646、0.626, P＜0.05），而MTT與VEGF表達呈負相關（r=－0.565, P＜0.05），見圖3。

3 討論

兔VX2種植瘤動物模型是目前能建立較大動物的可移植性腫瘤模型，VX2種植瘤株是一種由Shop病毒誘發(fā)的鱗狀細胞癌腫瘤細胞株，可以接種到中、大型動物體內的腎臟、肝臟、肌肉等組織器官內，制作原位腫瘤動物模型[7]，誘導時間短、成瘤率高、種植后組織學穩(wěn)定，并有新的血管生成[8]。CT平掃及增強掃描與人體細胞原位癌CT表現(xiàn)相似[9]，本實驗采用腫瘤組織塊直接移植的方法成功復制出兔門靜脈VX2種植癌模型。在腫瘤移植后2～3周，即供瘤血管形成期，對腫瘤血管發(fā)生最活躍的部位重點進行灌注成像研究，對于灌注參數(shù)的變化能否用于反映腫瘤新生血管生成變化的研究更有意義，同時采用CT灌注成像的去卷積數(shù)學模型，該模型利用推動剩余函數(shù)計算對比劑靜脈流出，對灌注的流入動脈和流出靜脈進行綜合考慮，計算HBF、HBV和MTT時不需要對潛存的脈管系統(tǒng)進行假設，與實際的血流動力學相近，計算出的灌注參數(shù)和函數(shù)圖更能反映病變內部的實際情況[10]。

圖3 兔門靜脈種植VX2癌栓VEGF表達與HBF（A）、HBV（B）、MTT（C）、PS（D）的相關性

通過對常規(guī)CT增強圖像與灌注參數(shù)圖進行對比發(fā)現(xiàn)，灌注成像中所顯示的瘤灶范圍明顯比CT增強掃描所顯示的病灶范圍大，增強圖像顯示正常的瘤灶周圍肝組織在灌注圖像中HBF、HBV、PS值明顯增高，高于遠離瘤灶肝組織各灌注參數(shù)，提示常規(guī)CT增強掃描顯示正常的瘤灶周圍肝組織多已被癌細胞所浸潤，只是未出現(xiàn)形態(tài)學改變而很難在常規(guī)CT圖像中呈現(xiàn)，而灌注圖像顯示的瘤灶邊緣輪廓才是瘤灶周圍浸潤情況的真實體現(xiàn)，這對于臨床制訂合理有效的治療方案及預后判斷有重要的指導意義。

灌注圖像中腫瘤周圍區(qū)HBF及HBV顯著增高，提示大量新生血管存在于腫瘤周圍區(qū)域[10]，PS增高表明腫瘤周圍區(qū)新生的大量血管缺乏完整的基底膜，提示在VEGF的刺激下腫瘤組織新生出大量內皮發(fā)育不良的毛細血管，由于血管通透性高，造影劑容易由血管向周圍組織間隙擴散，并在組織中存留。在CT增強掃描中，較高濃度的對比劑會增強組織強化程度，HBF、HBV、PS增高也同時反映了組織間隙濾過率會隨對比劑濃度的增加而升高[11]。

MTT值降低，提示腫瘤組織內毛細血管表面通透性增加。本實驗檢測的兔門靜脈VX2種植癌均已經(jīng)生長2周，瘤體已進入血管生成旺盛期，腫瘤細胞通過自分泌和旁分泌方式過多地分泌VEGF等促血管生成因子[12]，VEGF能誘導血管內皮細胞遷徙并不斷分裂、增殖，使血管生成調控紊亂，形成大量的腫瘤血管[13,14]，進而導致兔門靜脈VX2種植癌栓組織的HBF及HBV較正常的肝組織高。由于惡性腫瘤微血管的內皮細胞是不完整的，基底膜被基質金屬蛋白酶降解而不完整，部分毛細血管壁缺乏內皮細胞，血管內皮細胞之間連接松散，細胞間隙比較大，導致腫瘤組織內毛細血管表面通透性增加[15]，當?shù)鈱Ρ葎┩ㄟ^時容易引起對比劑外滲，為腫瘤血管的特點。本實驗測得的兔門靜脈VX2種植癌組織的PS高于正常肝組織，也正是由于腫瘤組織HBV和HPS增高而導致其MTT縮短。正常肝組織與非腫瘤區(qū)肝組織HBF、HBV、MTT、PS無明顯差異，表明肝總血流量基本不受肝腫瘤的影響，整個肝臟保持著相對平衡的血供。

本次動物實驗研究中門靜脈種植癌栓的CT灌注參數(shù)HBF、HBV和PS值與VEGF陽性表達呈正相關，MTT值與VEGF陽性表達呈負相關。種植癌栓內部新生微血管的功能狀態(tài)密切影響著種植癌栓的生長、浸潤、轉移及預后，血管內皮細胞通過分泌促血管生長因子（主要是VEGF）濃度上調即VEGF在兔VX2種植癌細胞質內的表達增高[13]，使腫瘤周圍原有的小血管內皮細胞被激活，經(jīng)過分裂、增殖，以類似出芽的方式形成血管條索，再形成中空的小管，相互連接吻合形成毛細血管網(wǎng)，并與原有的血管相連通，逐漸分化小動脈和小靜脈，建立起供應腫瘤細胞的血管網(wǎng)[14]，這些新生血管的血管壁不完整，相鄰血管內皮細胞間隙較大，因此其通透性較正常血管明顯增加，腫瘤細胞容易進出血管，通過血管浸潤周圍組織并向遠處播散，因此腫瘤的新生血管情況是評價腫瘤生長、浸潤、轉移及惡性程度的重要指標之一[15]。影像學檢查不能直接觀察到新生血管，但新生血管能引起灌注量、血容積、毛細血管通透性等的改變，MSCT灌注成像通過分析腫瘤內部的血管灌注特點，可以對單位腫瘤組織內的血容量、血流量和微血管通透性進行定量分析，從而間接反映腫瘤血管的功能狀態(tài)[16]。

總之，兔門靜脈VX2種植癌MSCT 灌注成像能夠在活體評價種植癌栓新生血管的生成情況，并提供量化功能信息，將免疫組化檢查和功能影像學方法相結合評價兔門靜脈VX2種植癌模型的微血管生成，為肝癌患者門靜脈癌栓的深入臨床研究提供實驗依據(jù)。MSCT灌注成像作為一種功能成像方式獲得并分析門靜脈癌栓灌注參數(shù)，可以間接反映門靜脈癌栓的VEGF表達程度，對評價腫瘤內血管生成情況有一定的價值。然而CT灌注掃描對患者的電離輻射劑量較大，如何防護和控制輻射劑量尚需進一步研究。

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（本文編輯 張春輝）

Relationship Between CT Perfusion Parameters and Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Rabbits Portal Vein VX2 Implanting Tumor Emboli

PurposeTo establish rabbit VX2 tumor model and to explore the relation between perfusion parameters and the expression of the VEGF in the portal vein VX2 implanting tumor emboli.Materials and MethodsVX2 tumor was implanted in the portal vein of eight experimental rabbits. Multi-slice CT (MSCT) perfusion scan was performed after tumor formation to measure and compare portal vein tumor thrombus, hepatic blood fow (HBF) near tumor foci and far away from tumor foci, hepatic blood volume (HBV), probability of surface area product (PS) and mean transit time (MTT). The VX2 tumor emboli were then resected to analyze the relationship between the liver perfusion parameters and VEGF expression using immunohistochemical method.ResultsMSCT liver perfusion parameters were not statistically signifcant between foci close to or far away from the tumor (P＞0.05). The HBF, HBV and PS within the tumor emboli were higher than that in hepatic parenchyma (P＜0.05) and the MTT was higher (P＜0.05). There was positive correlation (r=0.711, 0.646 and 0.626, P＜0.05) between the HBF, HBV and PS of portal vein VX2 tumor emboli and VEGF expression, and there was negative correlation between MTT and VEGF expression (r=－0.565, P＜0.05).ConclusionMSCT perfusion parameters in the portal vein VX2 implanting tumor emboli and the expression of VEGF are positively related. MSCT can evaluate the angiogenesis of portal vein VX2 implanting tumor emboli.

Liver neoplasms, experimental; VX2 neoplasms; Portal vein; Tomography, spiral computed; Perfusion imaging; Hemodynamics; Vascular endothelial growth factor; Disease models, animal; Rabbits

遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院放射科 遼寧錦州121001

雷 振

Department of Radiology, the First Affliated Hospital, Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, China

Address Correspondence to: LEI Zhen

E-mail: 862759769@qq.com

R-33；R445.3

2014-03-03

：2014-07-19

中國醫(yī)學影像學雜志

2014年 第22卷 第9期：650-654

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(9): 650-654

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.09.003