益生菌治療成人特應性皮炎療效評價

姜麗亞 郭 震 戴景斌 趙炳波

益生菌治療成人特應性皮炎療效評價

姜麗亞 郭 震 戴景斌 趙炳波

目的: 評價益生菌治療成人特應性皮炎(AD)的療效。方法: 40例AD患者隨機分為A組和B組,A組給予抗組胺藥、0.05%地奈德乳膏及益生菌制劑,B組僅給予抗組胺藥和0.05%地奈德乳膏,兩組均治療12周。20名健康者作為對照。治療前、后及治療后2個月用SCORAD和VAS法進行病情評分,并用PCR熒光定量法檢測受試者糞便中的細菌水平。結果: 治療結束時,A組、B組評分較治療前均顯著降低(P＜0.01)；停藥2個月時,A組評分仍低于治療前(P＜0.01),而此時B組評分與治療前相比無統(tǒng)計學差異。治療前A、B組雙歧桿菌及乳酸桿菌的數量明顯低于健康對照組(P＜0.01)。治療結束及停藥2個月時,A組兩種桿菌較治療前均顯著增加(P＜0.01),B組兩種桿菌較治療前均無顯著差異。結論: 益生菌可通過增加腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌菌群而改善病情并延緩復發(fā)。

腸道菌群； 特應性皮炎； 益生菌

近年來,特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)腸道菌群狀況異常與AD的關系受到重視,有研究報道嬰幼兒AD存在腸道微生物菌群失調,益生菌在預防和治療兒童過敏性疾病(如AD)有效。1,2但目前對益生菌治療成年AD的研究較少,本實驗對成年AD患者的腸道菌群狀況及益生菌對該病療效進行了研究。

1 材料與方法

1.1 病例資料 我院皮膚科門診就診的37例AD患者入選本實驗,均符合Hanifin和Rejka AD診斷標準；3無其他伴發(fā)癥及系統(tǒng)疾病,治療前2周內未外用糖皮質激素治療；1個月內未系統(tǒng)使用過糖皮質激素；6個月內未系統(tǒng)使用過益生菌、抗生素、環(huán)孢素或中藥治療,隨機分為A組和B組。A組19例:男9例,女10例,年齡19～42歲,平均32.21±1.46歲,病程14～43年,平均30年；B組18例:男10例,女8例,年齡19～44歲,平均30.71±2.06歲,病程14～42年,平均31年。本院體檢的健康人20名作為正常對照,男11名,女9名,年齡20～43歲,平均31.67±1.89歲。對照組排除過敏性哮喘,過敏性結膜炎,食物過敏等過敏性體質者。A、B組及健康對照組在性別、年齡方面具有可比性。

1.2 治療方法 A組給予抗組胺藥、0.05%地奈德乳膏及益生菌制劑:益生菌選用雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(國藥準字S19980004),成分為長型雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌,4片/次,日3次,共12周。B組患者給予抗組胺藥及0.05%地奈德乳膏。治療期間,避免含有任何活菌的發(fā)酵食品,避免系統(tǒng)應用抗生素。治療前后所有患者均進行血常規(guī)、尿常規(guī)及肝腎功能檢測。

1.3 臨床療效判定 在治療前后、停藥2個月時進行SCORAD和VAS評分,評價療效。

采用SCORAD計分系統(tǒng)對AD皮損及臨床嚴重度進行評估,4包括皮膚病變范圍(A)、皮膚嚴重程度(B)、瘙癢和睡眠影響程度(C)。A:成人頭頸部、臀部各9%,軀干前后各13.5%,下肢各22.5%；14歲以下兒童頭頸部、臀各9%,軀干前后及下肢各18%,1%面積為1分。B:按上述部位0～3四級評分,癥狀、體征包括紅斑、丘疹或水腫、表皮剝脫、裂紋或皸裂、滲出或結痂、苔蘚化、皮膚干燥(評未受累皮膚)。C:按最近3晝夜平均評分,0～3四級評分法,總分＜15分為輕度；15～40分為中度；＞40分為重度。

采用視角模擬尺度分法(visual analogue scale, VAS)對瘙癢程度進行評價:用長度為10 cm的標尺,兩端10～0分別代表最癢至不癢,讓患者將游標放置在能代表其瘙癢程度的位置上,醫(yī)生讀出評分結果。

1.4 腸道菌群檢測

1.4.1 實驗材料和儀器 恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY－2102C(上海智城分析儀器制造有限公司),－80℃超低溫冰箱(美國Thermo Forma公司),H fsafe－1200TE全排型生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司),超凈工作臺VS－1300L－U(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司),低溫離心機Sigma 3K15(Sigma公司),電熱恒溫水浴鍋HH－S(上海比朗公司),純水器(法國Milipore公司),移液器(德國Eppendorf公司),核酸蛋白檢測儀Nanodrop 2000(Thermo公司),9700基因擴增儀(美國Applied Biosystems公司),電泳儀(Bio rad公司)及凝膠成像分析系統(tǒng)2200(美國阿爾法公司)。DNA分子標準marker(LIFE SCIENCE公司), TAE緩沖液(上海創(chuàng)賽科學儀器有限公司)等。普通DNA產物純化試劑盒(離心柱型)、細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、熒光染料(SYBR Green I)、TaqDNA多聚酶等均購自北京天根生物公司。標準菌株ATCC29212(糞腸球菌)、ATCC25922(大腸桿菌)、引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表1。

1.4.2 糞便標本的采集 分別取AD患者治療前后、停藥2個月時及健康對照者的新鮮糞便,用天平稱取中段大便,每例取500mg,提取糞便細菌DNA,－20℃保存?zhèn)溆?。PCR熒光定量檢測糞便內的乳酸桿菌,雙歧桿菌,大腸桿菌,糞腸球菌,屎腸球菌含量。

1.4.3 檢測方法 分別提取2種標準菌株ATCC29212(糞腸球菌)、ATCC25922(大腸桿菌)和3例正常對照者糞便中屎腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌基因組DNA進行常規(guī)PCR反應,取PCR反應產物電泳檢測引物的特異性；取上述5種細菌的基因組DNA進行特異性擴增、純化、稀釋、定量,制作標準曲線,以便為待測樣品的定量提供參照標準。將其余糞便標本中提取的DNA分別進行5種細菌的實時熒光定量PCR反應,反應體系:熒光染料9μL,上下游引物各1 μL,模板DNA 2.0μL,ddH2O 7μL,加石蠟油8μL,反應體積為20μL。反應條件:95℃預變性2 min,95℃變性20 s,雙歧桿菌57℃、乳酸桿菌58℃、大腸桿菌59℃、糞腸球菌60℃、屎腸球菌61℃退火30 s,68℃延伸30 s,40個循環(huán),74℃延伸1 min。每次實驗同時設標準品校正和ddH2O代替DNA模板作為陰性對照。反應完畢后根據溶解曲線分析PCR產物的特異性,并由PCR儀分析定量結果,每份糞便標本所含的5種細菌的拷貝數可通過循環(huán)數與標準曲線比較得到。結果以每克濕便的細菌拷貝數的對數(以10為底數)表示。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗數據以ˉx±s表示,數據分析應用SPSS 18.0軟件,進行t檢驗及方差檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 SCORAD和VAS評分結果 見表2。

2.2 熒光定量PCR檢測5種腸道細菌數量結果 見表3。引物特異性檢測結果及溶解曲線(單峰)均證明擴增產物單一。

表1 5種細菌的PCR擴增引物序列

表2 治療前后SCORAD和VAS評分比較

表3 各組糞便標本細菌定量檢測結果

2.3 不良反應 治療期間兩組患者均未見血、尿常規(guī)及肝腎功能異常及其它不良反應。

3 討論

腸道益生菌在誘導免疫耐受、抑制過敏性疾病的發(fā)生和改善癥狀方面起著重要的作用,嬰幼兒AD患者存在腸道菌群狀況異常。2,5本試驗結果提示成年AD患者也存在腸道菌群失調的情況,主要為雙歧桿菌及乳酸桿菌的數量明顯減少,而大腸桿菌、糞腸球菌和屎腸球菌的數量則無明顯變化。Roessler等6進行了一項隨機雙盲對照研究,結果顯示意大利成人AD病患組較健康組糞便乳酸桿菌數量降低,與我們的結果一致,但雙歧桿菌的數量與健康人無統(tǒng)計學差異,與本研究結果不同,這可能與兩研究間檢測方法、歐亞地區(qū)人種及飲食習慣不同有關。

益生菌是一類定居在腸道中的有益細菌,有助于改善腸道免疫屏障功能、調節(jié)機體的免疫反應、降低腸道炎癥反應。益生菌對預防、治療過敏性疾病有效,可以減輕AD和牛奶過敏兒童的皮膚及腸道炎癥。7,8本試驗結果顯示,口服益生菌12周能明顯上調AD患者腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌的數量,停藥后2個月時上述2種細菌的數量仍可以維持在正常水平,同時非益生菌組患者僅在治療結束時SCORAD和VAS評分較治療前改善,好轉原因考慮與基礎用藥(抗組胺藥物及外用藥物)對病情改善有關,但停藥后2個月時病情有反復；益生菌組的患者在經過12周的益生菌及常規(guī)治療后SCORAD和VAS評分均較治療前明顯改善,且停藥后2個月病情無明顯反復,考慮與口服益生菌改善腸道內環(huán)境、加強腸道免疫屏障功能、減輕菌群失調所致的變態(tài)反應有關。

本實驗結果表明,成年AD患者的腸道菌群與正常人群存在差異；口服益生菌可改善AD患者的腸道菌群,且無明顯不良反應,可為過敏性疾病的防治提供有效的途徑。但本實驗樣本量較小,今后開展多中心、大樣本、雙盲對照研究,將會更全面地反映成人AD患者腸道菌群的情況及益生菌治療AD的療效及機制。

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(收稿:2014－01－18 修回:2014－02－08)

Assessment of efficacy of probiotics in the treatment of atopic dermatitis

JIANG Li-ya,GUO Zhen,DAIJing－bin,etal.Liaocheng People′s Hospital,Liaocheng,252000

Objective:To evaluate clinical efficacy of probiotics for the treatment of adult AD patients.Methods:Forty patientswere enrolled in thisstudy and divided into two groups:the patients in the probiotics group were treated with antihistamine,topical steroid and probiotics.The patients in the non－probiotics group were treated with antihistamine and topical steroid only.The course of the treatment was 12 weeks.Twenty healthy peop le were used as control.The disease severity was assessed by SCORAD and VAS score at baseline,week 12 and month 2 after stopping the treatment.The change in fecalmicrobiota was detected by PCR.Results:The SCORAD and VAS scoreswere significantly reduced in the two groups(P＜0.01)after the treatment,compared with those before the treatment.Atmonth 2 after stopping the treatment,the SCORAD and VAS scores continued to be lower than those atbaseline in the probiotics group(P＜0.01),but not in the non－probiotics group.Before the treatment,the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli in stool of the two groupswas higher than that in the healthy control(P＜0.01).At end of the treatmentand month 2 after stopping the treatment,the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli was significantly increased(P＜0.01)in probiotics group,rather than in non－probiotics group.Conclusion:Probiotics can improve the clinical status of the disease through increasing the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli,and prolong relapse of AD.

intestinal flora；atopic dermatitis；probiotics

山東省聊城市人民醫(yī)院,聊城,252000