芍藥苷對黑素細胞生物活性的影響

徐麗麗郁 博姚如永陳宏泉?趙秀峰倪少萍

·論著·

芍藥苷對黑素細胞生物活性的影響

徐麗麗1郁 博1姚如永2陳宏泉1?趙秀峰1倪少萍1

目的: 檢測芍藥苷對體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細胞增殖活性、酪氨酸酶活性及黑素合成的影響。方法: 建立正常人表皮黑素細胞培養(yǎng)體系,加入不同濃度(5～640μg/mL)芍藥苷并作用一定時間后,采用MTT法、體外氧化DOPA反應法、NaOH法等分別測定黑素細胞增殖活性、酪氨酸酶活性及黑素含量的變化。結果: 40～160μg/mL芍藥苷呈劑量依賴性抑制黑素細胞增殖,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；5～20μg/mL芍藥苷對酪氨酸酶活性呈劑量依賴性促進作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；10～20μg/mL芍藥苷對黑素細胞黑素合成起促進作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論: 芍藥苷在較高濃度范圍內(40～160μg/mL)對體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細胞增殖有劑量依賴性抑制作用；在較低濃度范圍內(10～20μg/mL)對其黑素合成有促進作用。

芍藥苷； 黑素細胞； 酪氨酸酶

芍藥苷(Paeoniflorin,PF)主要從毛茛科植物的根部提取,為黃酮類化合物,是白芍和赤芍的主要活性成分之一,以赤芍中含量為高,具有保肝、抗炎、免疫調節(jié)、擴血管、抗血栓形成、抗氧化等作用。芍藥苷因作用廣泛、毒性較低而具有較好的藥用前景。1黃褐斑及白癜風均為臨床常見的色素障礙性皮膚病,前者為面部的黃褐色色素沉著斑,后者則為色素脫失斑。目前芍藥復方制劑在治療黃褐斑中的有效性已有報道；2,3很多治療白癜風的中藥方劑中也含有芍藥成分,4但在黃褐斑及白癜風治療中芍藥的劑量及配伍不同。5,6皮膚顏色的深淺是由黑素細胞合成黑素數量的多少決定,黑素細胞位于表皮基底層,當皮膚受到紫外線照射或體內激素發(fā)生變化時,局部皮膚黑素細胞產生黑素量增加。7黑素合成過程中,酪氨酸經酪氨酸酶催化羥化為多巴并進而形成多巴醌,經DHI氧化酶和DHICA氧化酶的作用,生成真黑素,其中酪氨酸酶是黑素生成的起始限速酶。8

本實驗選取芍藥苷作為實驗藥物,采用人表皮正常黑素細胞作為受試細胞,就芍藥苷對其生物活性的影響進行體外實驗研究,以探討芍藥苷治療兩類障礙性皮膚病的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 皮膚標本 取包皮切除術切除的人正常包皮,供皮者年齡為15～25歲(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院低溫醫(yī)學科提供)。

1.1.2 主要試劑 芍藥苷(由寧波立華制藥惠贈,純度為95%,用完全培養(yǎng)基配制為1000 mg/L原液,過濾除菌后,入4℃冰箱避光貯藏,備用。臨用時稀釋成相應濃度),Dispase II酶(批號12594400)、胰蛋白酶、PBS、胎牛血清、F－12培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)、TritonX－100均購自青島福林生物化學有限公司,四甲基偶氮唑藍(MTT,Sigma,美國)、左旋多巴(L－DOPA,Sigma,美國)、NaOH粉末由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Heraeys公司),離心機(北京時代北利離心機有限公司),細胞培養(yǎng)板(青島福林生物化學有限公司),倒置顯微鏡(OLYMPUS)、自動酶標儀(BIO－RAD)、水平震蕩儀(Heidolph)等。

1.2 方法

1.2.1 黑素細胞原代培養(yǎng) 取包皮環(huán)切術標本,用1 ×PBS反復沖洗,PBS＋雙抗(1%青霉素/鏈霉素雙抗)浸泡15min,眼科剪去凈皮下組織。標本用Dispase II酶4℃消化24 h,分離真表皮。獲取的表皮1×PBS漂洗后剪成小塊,胰酶消化吹打成單細胞懸液,離心后接種于F12培養(yǎng)基,置5%CO237℃孵箱中培養(yǎng),待細胞貼壁后換液,以后每2 d換液1次,14～21 d細胞傳代。

1.2.2 MTT法測定芍藥苷對黑素細胞生長抑制率的測定 取對數生長期細胞,常規(guī)消化后調整細胞濃度為5×104個/mL,取200μL接種于96孔板,置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。共設立6個實驗組,每孔加200μL用培養(yǎng)基稀釋好的藥物,使各實驗組藥物終濃度分別為10、20、40、80、160、320μg/m L,每個濃度設立6個復孔。同時設立陰性對照組(培養(yǎng)基＋細胞組)和空白對照組(單純培養(yǎng)基組)。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待藥物作用24 h后,每孔加入20μL 5 mg/mL的MTT溶液,4 h后小心吸棄上清,每孔加入100μLDMSO溶液,置于水平震蕩儀震蕩10 min使結晶充分溶解。酶標儀空白孔調零,測定各孔490 nm處的A值。各實驗組的黑素細胞抑制率計算公式為:細胞生長抑制率＝(1－各濃度平均A值)/對照組平均A值×100%

1.2.3 測定芍藥苷對黑素細胞黑素合成量的影響采用NaOH裂解法,9細胞接種方法及分組同上。芍藥苷作用24 h后,吸棄上清,用1×PBS溶液清洗2遍,每孔加入100μL濃度為1 mol/L的NaOH溶液,置37℃水浴鍋作用1 h。酶標儀空白孔調零后測定460 nm波長處的A值。各實驗組相對黑素含量＝(實驗組A值－空白對照組A值)/(陰性對照組A值－空白對照組A值)×100%。

1.2.4 測定芍藥苷對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響采用體外氧化DOPA反應法,10細胞接種方法和分組同上。藥物作用24 h后,小心吸去上清液,用1× PBS液清洗2遍,每孔加入10 m L/L的Triton X－100溶液90μL,震蕩5 min溶解細胞,經37℃預溫后每孔加人l%的L－多巴10μL,37℃孵育30 min。于490 nm波長處空白孔調零后,測各孔A值。酪氨酸酶相對活性＝(含藥組A值－空白組A值)/(對照組A值－空白組A值)×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 各組數據用ˉx±s表示,采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,多組間比較采用單因素方差分析進行分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 芍藥苷對黑素細胞生長的影響 芍藥苷作用24 h后,40～640μg/mL黑素細胞生長呈抑制狀態(tài),與對照組相比均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),且40～160μg/ mL濃度組組間比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),160～640μg/mL實驗組組間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。見表1、圖1。

2.2 芍藥苷對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響 根據MTT結果選取5～160μg/m L濃度組,藥物作用細胞24 h后,各組酪氨酸酶活性均提高,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中,5～20μg/mL濃度組酪氨酸酶活性提高呈劑量依賴性。20～160μg/ m L組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。見表1、圖2。

圖1 不同濃度芍藥苷對黑素細胞活力抑制率(%)

圖2 不同濃度芍藥苷對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響(%)

2.3 芍藥苷對黑素細胞黑素合成量的影響 實驗濃度如上,藥物作用細胞24 h后,10～160μg/mL濃度組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),各實驗組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1、圖3。

圖3 不同濃度芍藥苷對黑素細胞黑素含量的影響(%)

3 討論

本實驗證實,芍藥苷在40～640μg/mL濃度組對體外培養(yǎng)的黑素細胞增殖抑制率與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),在40～160μg/m L濃度組抑制率呈劑量依賴性提高,提示芍藥苷在高濃度40～160μg/mL時劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)黑素細胞增殖。李劍等11研究發(fā)現(xiàn)中藥單體芍藥苷10～160μg/ mL可促進黑素細胞增殖,本實驗結果與其不符,可能與藥物產地、純度等不同有關。

劉之力等12觀察了56種中藥對酪氨酸酶的影響,發(fā)現(xiàn)27種對酪氨酸酶活性具有激活作用,并在活體棕色豚鼠上外用對酪氨酸酶具有激活作用的中藥,結果顯示部分中藥可使豚鼠皮膚黑素顆粒增加。雷鐵池等13觀察了86種中藥對酪氨酸酶的影響,發(fā)現(xiàn)19種對酪氨酸酶活性具有激活作用,其中包括赤芍。許愛娥等14選取白癜風治療中使用頻率較高的48種中藥,測定其對酪氨酸酶的作用,結果顯示13種對酪氨酸酶有激活作用,其中包括白芍,與劉之力等12的研究結果部分不同。

本實驗證實,芍藥苷在5～160μg/mL濃度時,對體外培養(yǎng)黑素細胞酪氨酸酶活性具有促進作用,各實驗組與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),在5～20μg/m L濃度時呈劑量依賴性。40～160μg/m L濃度組組間無差異(P＞0.05)。在相同條件下,對黑素合成具有促進作用,其中10～160μg/m L實驗組與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),實驗組組間無差異(P＞0.05)。說明芍藥苷在較低濃度時10～20 μg/mL即有與高濃度相近的對黑素細胞黑素合成的促進作用,李劍等11證實中藥單體芍藥苷在20μg/mL濃度時增強酪氨酸酶活性及促進黑素合成,與本實驗結果相近。

本實驗酪氨酸酶活性提高及黑素合成量增多并未呈平行增高趨勢,說明芍藥苷在促進酪氨酸酶活性機制之外,還可能通過其他途徑影響黑素的產生。隨著芍藥苷藥物濃度的升高,其抑制細胞增殖的作用增強、細胞活力下降從而導致黑素合成量下降,同時亦可能作用于黑素合成的其他環(huán)節(jié),如抑制其他酶的活性、影響黑素轉運和黑素降解等途徑。8,12

本實驗中,芍藥苷在高濃度(40～160μg/mL)時劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)黑素細胞增殖,因此推測高濃度芍藥苷可應用于黃褐斑等色素沉著性皮膚病的治療。芍藥苷在低濃度(10～20μg/mL)時相對黑素含量與高濃度組相比無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05),提示芍藥苷在較低濃度時就達到與較高濃度相似的促進體外培養(yǎng)黑素細胞黑素合成的作用,可為其治療白癜風提供一定的理論參考價值。

本實驗通過研究不同濃度芍藥苷作用后黑素細胞活力及酪氨酸酶活性、黑素含量的變化,探討了芍藥苷治療黃褐斑及白癜風兩類色素障礙性皮膚病的可能機制,為不同濃度的芍藥苷制劑治療色素障礙性皮膚病提供了實驗理論基礎,有利于該藥物的進一步開發(fā)與應用。

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(收稿:2013－11－28 修回:2013－12－25)

Effect of paeoniflorin on biological activity in normal human malanocytes in vitro

XU Li-li,YU Bo,YAORu-yong,et al.Department ofDermatology,the Affiliated Hospital ofQingdao University,Qingdao,266003

Objective:To investigate the effect of paeoniflorin on cell proliferation,tyrosinase activity and melanin synthesis in cultured normal human melanocutes.Methods:After paeoniforin(5～640μg/mL)was added into cultured normal humanmalanocytes,the effect of paeoniflorin on the proferation ofmelanocytes,tyrosinase activity and synthesis ofmelanin inmelanocytes weremeasured by MTTmethod,dopamine oxidation method and NaOH method,respectively.Results:40～160μg/mL paeoniflorin inhibited the growth ofmelanocytes in a concentration－dependentmanner(P＜0.05).When the concentrations of5～20μg/mL paeoniforin were added,the tyrosinase activity was significantly increased in a concentration－dependentmanner(P＜0.05).When the concentrations of10～20μg/mL paeoniforin were added,themelanin synthesiswere significantly increased(P＜0.05).The differences in the resultsmentioned above among the testgroups and control group were significant(all P s＜0.05).Conclusion:Paeoniflorin in concentrations of 40～160μg/mL can inhibit the proliferation in cultured normal human malanocytes in a concentration－dependentmanner.When the concentration of 10～20μg/mL is used themelanin synthesis is promoted.

paeoniflorin；melanocyte；tyrosinase

山東省中醫(yī)藥科學技術項目(編號:2011－199)

山東省科技發(fā)展計劃(編號:2011YD18012)

青島大學附屬醫(yī)院,青島,266003

?通信作者