羅格列酮對BIU-87膀胱癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移能力的影響

何 毅，李映川，章 卓

(瀘州醫(yī)學(xué)院1.附屬醫(yī)院泌尿外科;2.藥理教研室，四川瀘州646000)

膀胱癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤第9位，發(fā)生機(jī)制尚不清楚，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activatcd receptor-γ，PPAR-γ)是一種細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖密切相關(guān)，PPAR-γ 可能與膀胱癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)［1］。羅格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物，是過氧化物酶體增殖物激活受體激動(dòng)劑。據(jù)此，通過羅格列酮干預(yù)后觀察BIU-87 膀胱癌細(xì)胞系的侵襲和黏附能力，可以判斷PPAR-γ 與膀胱癌體外侵襲和黏附能力的關(guān)系，為膀胱癌可能的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑:BIU-87 膀胱癌細(xì)胞系(上海拜力生物試劑有限公司);PPAR-γ 激動(dòng)劑羅格列酮(浙江萬馬公司);Transwell小室(Costar Cambridge 公司);Matrigel 膠;趨化因子人纖連蛋白(BD 公司);CCK-8 試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);兔抗人PPAR-γ、MMP-9 和β-actin 抗體及羊抗兔二抗(Abcam 公司)。

1.2 CCK-8 法檢測羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細(xì)胞活力影響:BIU-87 膀胱癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。取5 ×105個(gè)/L 對數(shù)增殖期BIU-87 膀胱癌細(xì)胞接種到96 孔板中，24 h 后將96 孔板分為對照組、羅格列酮5、10、20、40 和80 mg/L 組，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，處理24 h 后每孔加入CCK-8 10 μL 繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值，以A 值反映細(xì)胞活力情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。抑制率= (1－實(shí)驗(yàn)組A 值/對照組A值)×100%。

1.3 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響:Transwell 小室4 ℃預(yù)冷，將趨化因子人纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)涂于小室下層，Matrigel 膠包被于小室上層，37 ℃孵育1 h。根據(jù)1.2 結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)分為對照組、羅格列酮10 和20 mg/L組。實(shí)驗(yàn)步驟為先將對數(shù)生長期的BIU-87 膀胱癌細(xì)胞經(jīng)羅格列酮處理24 h，對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)不作處理。之后收集細(xì)胞，取5×105個(gè)/L 細(xì)胞懸浮于小室的上層，小室下方加入含0.1%牛血清蛋白的培養(yǎng)基600 μL，37 ℃孵育24 h。經(jīng)多聚甲醛固定，HE 染色。每組4 個(gè)復(fù)孔，顯微鏡下選取5 個(gè)視野計(jì)算穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值和比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細(xì)胞黏附能力的影響:實(shí)驗(yàn)分組同1.3。羅格列酮處理24 h 后，收集細(xì)胞5 ×105個(gè)/L接種在鋪有Matrigel 膠的24 孔板中，37 ℃孵育1 h，棄培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，加入20 μL MTS，37 ℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定黏附在Matrigel 膠上細(xì)胞的A 值(波長490 nm)。

1.5 免疫印跡法檢測PPAR-γ 和MMP-9 蛋白表達(dá):實(shí)驗(yàn)處理同1.3，將細(xì)胞加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液0.5 mL冰上裂解。轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，4 ℃12 000 × g 15 min，吸取上清。采用4%濃縮膠和8%分離膠，SDS-PAGE電泳，100 V 轉(zhuǎn)膜120 min，轉(zhuǎn)膜后將硝酸纖維素膜放入封閉液中，搖床緩慢搖動(dòng)，封閉1.5 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，加入二抗，孵育，洗膜。以β-actin 為內(nèi)參，用圖像分析儀對條帶進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細(xì)胞活力影響:40 mg/L 以上濃度羅格列酮對細(xì)胞有嚴(yán)重不良反應(yīng)(圖1)。

2.2 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細(xì)胞黏附能力與侵襲能力的抑制作用:10 mg/L 與20 mg/L 羅格列酮使BIU-87 膀胱癌細(xì)胞黏附能力降至對照組的61.2% 和38.6% (P＜0.05)，10 和20 mg/L 羅格列酮使BIU-87 膀胱癌細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)減弱(P＜0.05)，PPAR-γ 表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)(圖2)，侵襲能力是對照組的42.3% 和21.6%(P＜0.05)(圖2)。10 和20 mg/L 羅格列酮使BIU-87 膀胱癌細(xì)胞MMP-9 蛋白表達(dá)減弱(P＜0.05)，PPAR-γ 表達(dá)增加(P＜0.05)(圖2)。

圖1 不同濃度羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細(xì)胞活力影響Fig 1 Effects of rosiglitazone on BIU-87 cells vitality

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移包括腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，穿越基質(zhì)組織和血管壁，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。膀胱癌患者保留膀胱術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)50%［2］。膀胱癌的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移涉及多種因素，PPAR-γ 與MMP-9 都與膀胱癌該轉(zhuǎn)移有關(guān)。PPAR-γ 是一種細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖密切相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)參與了膀胱癌的轉(zhuǎn)移，MMP-9 可能通過降解包括基底膜Ⅳ型膠原在內(nèi)的細(xì)胞外成分，使癌細(xì)胞向深層間質(zhì)浸潤的同時(shí)也突破淋巴管和血管的基底膜而向脈管浸潤，最終發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。已有研究表明羅格列酮可通過激活PPAR-γ而發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過羅格列酮干預(yù)，觀察PPAR-γ 表達(dá)增加后對膀胱癌細(xì)胞體外黏附能力與侵襲能力的影響，同時(shí)檢測MMP-9 蛋白表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羅格列酮干預(yù)后，BIU-87 膀胱癌細(xì)胞黏附能力與侵襲能力下降明顯，證實(shí)PPAR-γ 激動(dòng)后可以影響膀胱癌細(xì)胞侵襲能力和黏附能力，提示PPAR-γ 參與了膀胱癌的轉(zhuǎn)移過程。同時(shí)BIU-87 膀胱癌細(xì)胞MMP-9 蛋白表達(dá)減弱，提示羅格列酮在激動(dòng)PPAR-γ 時(shí)可能對MMP-9 還存在抑制效應(yīng)，對膀胱癌細(xì)胞侵襲能力和黏附能力的影響可能也與抑制MMP-9 蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，PPAR-γ 在膀胱癌轉(zhuǎn)移中有重要價(jià)值，這為今后進(jìn)一步以PPAR-γ 基因作為靶點(diǎn)應(yīng)用于膀胱癌的治療提供了科學(xué)依據(jù)。

圖2 羅格列酮對BIU-87 膀胱癌細(xì)胞黏附能力與侵襲能力的抑制作用及對MMP-9 和PPAR-γ 蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of rosiglitazone on adhesion ability and invasion ability of BIU-87 cells(n=4)and the expressions of MMP-9 and PPAR-γ(n=3)

［1］Sugiyama N，Yoneyama MS，Hatakeyama S，et al．In vivo selection of high-metastatic subline of bladder cancer cell and its characterization［J］．Oncol Res，2013，20:289-295．

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