劉逢秋,管小琴,王婭蘭,蘇 晏
(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心,重慶400016)
單腺苷二磷酸核糖基化(mono-ADP-ribosylation)是由單腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶(mono-ADP-ribosyltransferases,mono-ARTs)催化的一種蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾,其將ADP-核糖從NAD +轉(zhuǎn)移到受體蛋白特定的氨基酸位點如精氨酸、半胱氨酸殘基上。又可根據(jù)接受單腺苷二磷酸核糖基化作用的不同氨基酸種類,將其分為4 種亞型。精氨酸特異性單腺苷二磷酸核基化就是其中重要一種[1]。
MIBG 是一種去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)胍類似物。放射性131I 標(biāo)記的MIBG 在臨床上作為腫瘤靶放射藥物來診斷和治療腎上腺腫瘤。而未放射標(biāo)記的MIBG 可以影響多種細(xì)胞生物學(xué)功能。目前研究發(fā)現(xiàn)MIBG 能夠特異性抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化的功能。因MIBG 其化學(xué)結(jié)構(gòu)與精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶催化的底物結(jié)構(gòu)類似,從而可以競爭性抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用[2]。通過加入MIBG 能引起細(xì)胞膜到細(xì)胞核的一系列信號的傳導(dǎo)的改變最終可抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[3]。
本實驗通過使用MIBG 抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用,進(jìn)一步探究其對肝癌HepG2 細(xì)胞增殖的影響。
新生小牛血清(四季青公司);RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(HyClone 公司);PMSF,PIPA 裂解液(Beyotime);MIBG(Sigma 公司);ART1 多克隆抗體(SANTA 公司與Sigma 公司);兔抗山羊IgG/FITC標(biāo)記抗體(中衫金橋);RhoA,c-myc 多克隆抗體(武漢山鷹公司);cyclin A1 多克隆抗體(博士德生物);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(北京博奧森);BCA 試劑盒(碧云天公司)。
1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):人肝癌HepG2 細(xì)胞株用含10%新生小牛血清、100 U/mL 青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,待細(xì)胞匯合至80%左右。PBS 清洗3次加入胰蛋白酶消化離心后傳代處理。
1.2.2 細(xì)胞免疫熒光實驗檢測:ART1 在HepG2 中的表達(dá):將滅菌處理后的玻璃爬片放入6 孔板中,HepG2 細(xì)胞以1 ×106cells/L 接種于6 孔板,待細(xì)胞匯合至玻璃爬片60% 左右,取出爬片PBS 清洗3次。用10%甲醛固定30 min,在用PBS 清洗3 次每次2 min,加入0.5% Triton 處理15 min,PBS 洗2次,每次5 min。然后1%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min,在用1∶100 的ART1 抗體4 ℃孵育過夜,對照組PBS 代替一抗做陰性對照。過夜后PBS 清洗3次,每次5 min,加入濃度為1∶50 的兔抗山羊IgG/FITC 標(biāo)記抗體,37 ℃避光雜交孵育1 h。孵育完畢后再用PBS 清洗3 次,每次5 min。最后用熒光抗淬滅封片液封片,熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
1.2.3 噻咗藍(lán)(MTT)比色實驗檢測細(xì)胞生存:HepG2細(xì)胞以1 ×106cells/L 接種于96 孔板,200 μL/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,加入MIBG 至所需的不同濃度,繼續(xù)培養(yǎng)12 h。每孔加入MTT(5 g/L)20 μL,37 ℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),棄去上清液,每孔加入150 μL 二甲基亞砜,輕輕振蕩10 min,使甲臜溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上,490 nm 波長測定各孔吸光值。細(xì)胞生存率=[(實驗組吸光值-空白組吸光值)/(對照組吸光值-空白組吸光值)]×100%。
1.2.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期:HepG2 細(xì)胞以1 ×106cells/L接種于6 孔板,2 mL/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,加入MIBG 至所需的不同濃度,繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液并用PBS 洗滌,離心后棄上清液,重新懸浮于4 ℃預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液中,緩慢加入-20 ℃預(yù)冷的95%乙醇,使其終濃度為70%。固定4 h 后流式細(xì)胞周期檢測。
1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá):將各組培養(yǎng)的細(xì)胞裂解之后提取蛋白,然后用BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度。5∶1 體積與蛋白上樣緩沖液混合,沸水中水浴5 min。按每孔相同蛋白總量加入凝膠,ART1、c-myc、cyclinA1 和β-actin 用10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,RhoA 用15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。然后再電轉(zhuǎn)到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉1 h。一抗c-myc、cyclinA1 濃度1 ∶300,ART1、RhoA 濃度1∶200,β-actin 濃度1∶500 4 ℃過夜。吐溫20/三羥甲氨基甲烷緩沖液(TBST)清洗3 次后用1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 孵育2 h,加入ECL 化學(xué)顯影試劑后凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照,檢測蛋白質(zhì)印跡條帶。
熒光顯微鏡下見HepG2 的胞膜、胞質(zhì)均有熒光。而用PBS 陰性對照的HepG2 細(xì)胞中則沒有(圖1)。
50μmol/L MIBG 開始,呈劑量依賴性抑制細(xì)胞存活(P<0.05)(表1)。
隨著MIBG 濃度的增加,處于S 期的細(xì)胞比例也隨之增加(P<0.05)(圖2,3)。
與對照組比較,實驗組ART1、RhoA、c-myc 和cyclinA1 蛋白表達(dá)水平降低。4 個指標(biāo)各組間兩兩比較均有差異(P<0.05)(圖4)。
圖1 細(xì)胞免疫熒光法檢測人肝癌細(xì)胞HepG2 中ART1 的表達(dá)情況Fig 1 The expression of ART1 in hepatoma carcinoma HepG2 cells detected by cellular immunofluore scence method(taken the pictures by fluores cence microscope,×400)
圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度MIBG 處理后的HepG2 細(xì)胞周期Fig 2 HepG2 cell cycle phases treated with different concentration of MIBG analysed by flow cytometry
表1 不同濃度MIBG 處理HepG2 細(xì)胞后MTT 法測量A 值以及細(xì)胞存活率Table 1 Effects of different concentration of MIBG on cell growth and cell survival rate in human HepG2 detected by MTT(±s,n=3)
表1 不同濃度MIBG 處理HepG2 細(xì)胞后MTT 法測量A 值以及細(xì)胞存活率Table 1 Effects of different concentration of MIBG on cell growth and cell survival rate in human HepG2 detected by MTT(±s,n=3)
*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.
concentration(μmol/L)MTT assay(A value/well)cell survival rate(%)0(Con.)1.222 ±0.024100 501.114 ±0.019*90.665 ±0.406*1001.027 ±0.053**83.208 ±3.093**1500.853 ±0.021**68.259 ±0.643**2000.854 ±0.032**68.300 ±1.391**2500.537 ±0.014**41.103 ±0.478**3000.474 ±0.012**35.689 ±0.223**
圖3 不同濃度MIBG 對HepG2 細(xì)胞周期的影響Fig 3 Effects of different concentration of MIBG on HepG2 cell cycle phases(±s,n=3)
單腺苷二磷酸核糖基化有4 種類型,而精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用是其中最重要的一種[1]。目前,關(guān)于精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化功能的生物學(xué)研究主要在結(jié)腸癌以及平滑肌細(xì)胞。精氨酸特異性單腺苷核糖基化作用能夠影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移以及參與腫瘤細(xì)胞凋亡過程[4-5]。因此,通過使用精氨酸特異性單腺苷核二磷酸糖基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑MIBG,來探究其是否具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。
催化精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用的ARTs 目前已發(fā)現(xiàn)多種亞型,不同的亞型在不同種屬和部位分布各不同。在目前已知的5 種ARTs中,只有ART1,2 和5 具有精氨酸特異性單腺苷核糖基化轉(zhuǎn)移酶的催化位點。因為ART2 在人類體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn),ART5 主要富集于睪丸中[6]。所以,初步推測在人體內(nèi)ART1 是催化精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用的主要酶。
圖4 蛋白印記實驗檢測各組中ART1,RhoA,c-myc,cyclinA1 蛋白表達(dá)水平Fig 4 The expressions of ART1,RhoA,c-myc,cyclin A1 proteins in HepG2 cells in different groups were respectively detected by Western blot(±s,n=3)
首先,通過細(xì)胞免疫熒光顯示ART1 在HepG2細(xì)胞具有高表達(dá),該結(jié)果提示HepG2 細(xì)胞中具有精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化這一蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用。再通過功能實驗MTT 以及流式細(xì)胞周期的分析表明,精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化抑制劑MIBG 能夠抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖,且主要是阻滯在S 期。
RhoA 蛋白是Rho 蛋白中最具代表性的一種,其也屬于Ras 家族蛋白中一員。具有激活和失活兩種狀態(tài),可通過Rho/RhoA 激酶(Rho kinase,ROCK)通路將胞膜信號傳導(dǎo)至胞核,從而調(diào)節(jié)c-myc 基因的表達(dá)[7-8]。c-myc 可以激活cyclin A 蛋白的表達(dá)[9]。細(xì)胞周期的調(diào)控主要由細(xì)胞周期素cyclins和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDKs)這兩類蛋白家族調(diào)控。cyclin A1在細(xì)胞周期S 期調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[10]。
研究證明小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞ART1 基因沉默后,精氨酸單腺苷二磷酸核糖基化作用減弱,RhoA 的表達(dá)活化水平降低。從而影響到ROCK 細(xì)胞信號通路,引起下游c-myc 的表達(dá)降低,可抑制小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[11]。
為了探究MIBG 抑制HepG2 細(xì)胞增殖的機制,進(jìn)一步檢測了ART1,RhoA、c-myc、cyclinA1 的表達(dá)。結(jié)果顯示,加入MIBG 后的HepG2 細(xì)胞ART1、RhoA、c-myc 和cyclinA1 表達(dá)水平降低。提示RhoA通路參與調(diào)節(jié)了肝癌HepG2 細(xì)胞增殖過程。通過加入MIBG 后,降低了ART1 表達(dá)水平和RhoA 的活化水平,進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞核內(nèi)c-myc 蛋白的表達(dá)水平,減低了cyclinA1 的表達(dá)。從而使HepG2 細(xì)胞發(fā)生S 期阻滯,增殖受到抑制。
本實驗發(fā)現(xiàn)MIBG 對人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖具有抑制作用,為臨床肝癌治療和藥物研究提供了新的靶點。MIBG 對其他腫瘤細(xì)胞增殖影響以及在其他生物學(xué)行為如凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等的影響以及是如何調(diào)控ART1 表達(dá)下調(diào)的機制還有待進(jìn)一步研究。
[1]Laing S,Unger M,Koch-Nolte F,et al.ADP-ribosylation of arginine[J].Amino acids,2011,41:257-269.
[2]Loesberg C,Smets L A.Meta-iodobenzylguanidine (MIBG),a novel high-affinity substrate for cholera toxin that interferes with cellular mono (ADP-ribosylation)[J].BBA-Protein Struct M,1990,1037:92-99.
[3]Lorraine Y,Brenda L,Shawn T,et al.Endogenous mono-ADP-ribosylation mediates smooth muscle cell proliferation and migration via protein kinase N-dependent induction of c-fos expression[J].Biochem,2003,270,101-110.
[4]宋光林,唐怡,王婭蘭,等.ART1 基因沉默對小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響及作用機制的研究[J].腫瘤,2013,33:490-496.
[5]Xiao M,Tang Y,Wang YL,et al.ART1 silencing enhances apoptosis of mouse CT26 cells via the PI3K/Akt/NF-κB pathway[J].Cell Physiol Biochem,2013,32:1587-1599.
[6]Zolkiewska A.Ecto-ADP-ribose transferases:cell-surface response to local tissue injury[J].Physiol,2005,20:374-381.
[7]Buchsbaum R J.Rho activation at a glance[J].J Cell Sci,2007,120:1149-1152.
[8]Satoh K,F(xiàn)ukumoto Y,Shimokawa H.Rho-kinase:important new therapeutic target in cardiovascular disease[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301:287-296.
[9]Pidder J,Albrecht M,Philipp S,et al.differential modulation of cyclin gene expression by MYC[J].Cell Biol,1993,90:3685-3689.
[10]Zhang KZ,Zhou XL,Liu JZ,et al.β-diketone-cobalt complexes inhibit DNA synthesis and induce S-phase arrest in rat C6 glioma cells[J].Oncol Lett,2014:881-885.
[11]徐劍俠,王婭蘭,唐怡,等.ARN 干擾ART1 表達(dá)對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響及其機制探討[J].腫瘤,2012,32:949-954.