人肺癌組織中MCPH1基因過(guò)表達(dá)后協(xié)同化療藥物抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖

何文婷，孟莎莎，吳曉彬

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院重慶市兒童重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地兒童疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)知發(fā)育與學(xué)習(xí)記憶障礙轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016)

肺癌(lung cancer，LC)，是肺部最常見的惡性腫瘤之一。在許多國(guó)家的惡性腫瘤當(dāng)中，肺癌的發(fā)病率占第一位［1］。傳統(tǒng)的放療和化療的手段并不能特異地殺傷癌細(xì)胞，同時(shí)也殺傷了組織中的大量正常細(xì)胞，給患者帶來(lái)非常嚴(yán)重的不良反應(yīng)。為了減輕傳統(tǒng)治療給患者帶來(lái)的痛苦和提高治療效果，靶向治療成為目前癌癥治療研究的熱點(diǎn)。

MCPH1 為原發(fā)性小頭腦基因，它編碼microcephalin 蛋白，也被稱作做BRIT1，最初是在篩選人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶阻遏物時(shí)被發(fā)現(xiàn)［2-4］。MCPH1(BRIT1)在DNA 損傷應(yīng)答通路中發(fā)揮著重要作用［5］。近期研究發(fā)現(xiàn)多種人類腫瘤中MCPH1 表達(dá)下調(diào)，如卵巢癌、乳腺癌等。本實(shí)驗(yàn)前期研究也發(fā)現(xiàn)宮頸癌樣本中MCPH1 基因表達(dá)下調(diào)［6］。

本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究MCPH1 基因在肺癌中的表達(dá)及作用，為臨床癌癥基因診斷、治療尋找新的靶點(diǎn)和標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RT-PCR 試劑盒(Toyobo 公司);轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 和Trizol 試劑(Invitrogen 公司);質(zhì)粒提取試劑盒(Omega 公司);RNA 抽提液(Roche 公司);蛋白提取試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒、MTS 試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);兔抗人BRIT1多克隆抗體(Abcam 公司);HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司);阿霉素、順鉑、紫杉醇(Sigma 公司)。

1.2 質(zhì)粒和細(xì)胞

真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(－)/ MCPH1(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心袁成福博士提供);pcDNA3.1(－)和A549 細(xì)胞(均為重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心保存)。

1.3 肺癌標(biāo)本

本實(shí)驗(yàn)用肺癌標(biāo)本，均取自重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)室，分為癌組織和癌旁組織兩組，共20 例，各標(biāo)本均已由細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究項(xiàng)目已被重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 引物合成及序列

MCPH1 及GAPDH 上下游引物均由TAKARA生物公司設(shè)計(jì)合成。MCPH1 基因正義鏈:5'-CACC ATCTTTCACTCACCTC-3'，反義鏈:5'-CTTTACTG AGGAACTCCTGG-3'，擴(kuò)增片段大小240 bp;內(nèi)參GAPDH基因(NM_002046)正義鏈:5'-ACCTGACCTG CCGTCTAGAA-3'，反義鏈:5'-TCCACCACCCTGTTG CTGTA-3'，擴(kuò)增片段大小227 bp。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)A549 細(xì)胞，以1 ×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)80% ～90%時(shí)，用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(－)/MCPH1 和空載體pcDNA3.1(－)(陰性對(duì)照組)，質(zhì)粒與脂質(zhì)體質(zhì)量比為1∶2。

1.6 Real-time PCR 檢測(cè)細(xì)胞中MCPH1 基因轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)染后48 h，用Trizol 試劑提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。以隨機(jī)引物在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為:30 ℃10 min，42 ℃20 min，99 ℃5 min。以合成的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，Quantity One 軟件進(jìn)行光密度分析。試驗(yàn)重復(fù)3 次。采用real time PCR 法。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行real time PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件:94 ℃變性5 min;94 ℃10 s;60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用2－△△Ct法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 Westen blot 檢測(cè)細(xì)胞中MCPH1 蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組細(xì)胞，提取蛋白，BCA 法定量。取20 μg 蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h;加入兔抗人BRIT1 多抗(1∶500 稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜;PBST 洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h;PBST 緩沖液洗膜3次，用ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)BRIT1 蛋白的表達(dá)。以β-actin 作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 MTS 比色法檢測(cè)細(xì)胞抑瘤率

取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度為1 ×108/L，將單細(xì)胞懸液100 μL 加入96孔培養(yǎng)板中，24 h 后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h 后每孔分別加入阿霉素1.0 μmol/mL、紫杉醇20 μg/mL、順鉑0.1 μg/mL，各組分別設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔及3 個(gè)對(duì)照孔，培養(yǎng)48 h 后，加入10 μL MTS 試劑，孵育4 h后，用酶標(biāo)儀(γ490 nm)測(cè)定每孔吸光度(A)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

藥物對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)期的抑制率按下式計(jì)算:抑制率(%)=(1－加藥孔平均A 值/對(duì)照孔平均A 值)×100%。應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值上標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間參數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MCPH1 基因在人肺癌組織中表達(dá)下調(diào)

在25 例肺癌標(biāo)本中，MCPH1 基因的表達(dá)，21例低于正常組，2 例高于正常組(圖1)。

圖1 Real-time PCR 數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖Fig 1 The data scatter plot of real-time PCR

2.2 轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞后，過(guò)表達(dá)MCPH1 的鑒定

2.2.1 mRNA 水平鑒定MCPH1 基因過(guò)表達(dá):實(shí)驗(yàn)組MCPH1 mRNA 表達(dá)值明顯低于空白對(duì)照組和未處理組(P＜0.05)。說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，實(shí)驗(yàn)組MCPH1基因過(guò)表達(dá)(表1)。

2.2.2 MCPH1 基因過(guò)表達(dá)蛋白水平鑒定:Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組2.18 ±0.13，顯著高于對(duì)照組為0.47 ±0.12(目的條帶/ β-actin)(P＜0.05)(圖2)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中MCPH1基因mRNA 的表達(dá)水平Table 1 Expression of MCPH1 gene in cells detected by Q-PCR (±s，n=3)

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中MCPH1基因mRNA 的表達(dá)水平Table 1 Expression of MCPH1 gene in cells detected by Q-PCR (±s，n=3)

groupMCPH1GAPDH2 －△△Ct OVER20.4 ±0.216.2 ±0.0119.5 ±2.9 W/O24.5 ±0.116.5 ±0.41.4 ±0.1 NC24.7 ±0.416.3 ±0.041 ±0.3

圖2 Western blot 檢測(cè)MCPH1 蛋白表達(dá)Fig 2 Protein expression of MCPH1 measured by Western blot

2.3 過(guò)表達(dá)MCPH1 協(xié)同化療藥物的細(xì)胞抑瘤率

MCPH1 過(guò)表達(dá)后，協(xié)同化療藥物阿霉素(ADM)、順鉑(DDP)、紫杉醇(TAX)的抑瘤率均超出空白對(duì)照組及未處理組20%左右(P＜0.05)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)MCPH1 協(xié)同化療藥物對(duì)于肺癌A549 細(xì)胞抑瘤率明顯升高(圖3)。

3 討論

在DNA 損傷的情況下，MCPH1 可以通過(guò)協(xié)調(diào)DNA 損傷應(yīng)答通路中的ATR 和ATM 通路來(lái)應(yīng)對(duì)多種損傷修復(fù)和監(jiān)視細(xì)胞周期，從而維持基因組的穩(wěn)定性。一旦MCPH1 突變失活，會(huì)導(dǎo)致S 期和G2/M期的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)丟失，這樣會(huì)造成損傷的DNA進(jìn)入子代細(xì)胞，從而引起子代細(xì)胞染色質(zhì)的不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定增加了其他腫瘤相關(guān)基因突變的可能性，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。敲出MCPH1 的小鼠基因組表現(xiàn)出了不穩(wěn)定性。在多種人類腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了MCPH1 的表達(dá)下調(diào)［7］。在人類腫瘤中BRIT 的異常表達(dá)表明MCPH1 可能是一個(gè)新的腫瘤抑制基因。

圖3 化療后細(xì)胞抑瘤率(%)對(duì)比Fig 3 Histogram tumor inhibition rate (%)of three chemotherapeutics

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織MCPH1 基因在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，這就意味著MCPH1 基因可能參與肺癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，且可能作為一種抑癌基因發(fā)揮作用。近年來(lái)，專家推測(cè)，該基因可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，但目前仍無(wú)其抗腫瘤作用的相關(guān)研究。本研究首次將該基因與抗腫瘤藥物聯(lián)系起來(lái)，為其將來(lái)作為一種新的抗腫瘤靶點(diǎn)藥物打下基礎(chǔ)。

阿霉素是為肺癌化療的一線藥物，它可以嵌入DNA 的堿基對(duì)之間干擾轉(zhuǎn)錄過(guò)程，阻止mRNA 的合成，最終通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而起到抗腫瘤作用。在肺癌治療中，單藥阿霉素有效率較低，心臟毒性是主要?jiǎng)┝肯拗菩砸蛩刂?紫杉醇在臨床上能引起廣泛的過(guò)敏反應(yīng);順鉑對(duì)骨髓有嚴(yán)重的抑制作用。因此，需要尋找一種增加化療藥物敏感性，促使肺癌細(xì)胞易于發(fā)生凋亡，從而減小化療藥物用量及不良反應(yīng)的新策略。本實(shí)驗(yàn)組前期試驗(yàn)過(guò)程中，已發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MCPH1 基因后，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［8］。本研究將臨床上常用的化療藥物與基因MCPH1 協(xié)調(diào)作用進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間有顯著協(xié)同作用，可能因?yàn)樵摶驅(qū)τ谀[瘤細(xì)胞促凋亡作用的原因，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，MCPH1 基因很可能作為一種抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中產(chǎn)生作用，并作為一種新的抗腫瘤靶點(diǎn)，協(xié)同其他化療藥物，應(yīng)用于臨床治療當(dāng)中。

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