TSA體外抑制人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖及機(jī)制

崔虎哲，王申桐，金鐵峰，周憲春，元奎昌，張松男

(延邊大學(xué)1.附屬醫(yī)院影像科;2.腫瘤研究所;3.附屬醫(yī)院科教處;4.附屬醫(yī)院心內(nèi)科;5.附屬醫(yī)院腫瘤科，吉林延吉133000)

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(pithelial-mesenchymal transition，EMT)是惡性腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，在肺癌的研究證實(shí)，EMT 與肺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1-2］。曲古抑菌素A(triehostatin A，TSA)是組蛋白去乙?；?histonedeaeetylase，HDAC)抑制劑，可促進(jìn)組蛋白的乙?；?、激活抑癌基因表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞分化或凋亡［3］。有研究表明TSA 可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖及遷移［4］，但其具體機(jī)制仍不清楚，尤其是TSA 調(diào)控EMT 在肺癌的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)探明TSA 抑制A549 細(xì)胞的作用機(jī)制，為臨床治療肺癌提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肺腺癌A549 細(xì)胞系和正常支氣管上皮16HBE 細(xì)胞系(ATCC);胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶和二甲基亞楓(DMSO)等化學(xué)試劑(北京華美公司);Western blot 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑及MTT 試劑(武漢博士德生物有限公司);EMT 相關(guān)標(biāo)志蛋白抗體(抗E-cadherin、抗Vimentin、抗Snail、抗GSK-3β 單克隆抗體)(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT 比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:將A549 及16HBE 細(xì)胞系接種于含10%胎牛血清、5%青霉素/鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對(duì)數(shù)增殖期的A549 及16HBE 細(xì)胞以2 ×103個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為0、0.01、0.1、1、10 和100 μmol/L 的TSA，每種濃度設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液。72 h 后加入50 μL/孔的MTT，4 h 后棄上清，加入200 μL/孔的DMSO，輕輕振蕩數(shù)分鐘，應(yīng)用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，并按公式計(jì)算細(xì)胞生存率:細(xì)胞生存率(%)=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%。

1.2.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲:將5 ×105個(gè)/mL 的A549 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，培育24 h。待細(xì)胞完全貼壁，用10 μL 移液槍槍頭在單層細(xì)胞上劃一條直線，用PBS 清洗3 次。分別加入含曲古抑菌素A(TSA)的培養(yǎng)液及不含TSA 的培養(yǎng)液，于0、24 和48 h 觀察并拍照。

1.2.4 Western blot 檢測(cè):A549 細(xì)胞經(jīng)TSA 作用24 h;(濃度分別為0.1、1 和10 μmol/L)以PBS 洗2次后提取總蛋白;BrdaZford 法測(cè)定蛋白濃度;8%SDS 聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行蛋白分離;轉(zhuǎn)至PVDF 膜上;室溫下?lián)u床封閉(TBSZT +5%脫脂奶粉)2 h;加入兔抗人E-cadherin、Snail、Vimentin、GSK-3β 和β-actin 的單克隆抗體;4 ℃過(guò)夜;室溫下洗膜;加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔IgG 二抗;孵育2 h;ECL 曝光;觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TSA 明顯抑制A549 細(xì)胞增殖

1、10 和100 μmol/L 的TSA 培養(yǎng)細(xì)胞72 h 后，與未加藥對(duì)照組相比，肺癌細(xì)胞A549 明顯受到抑制(P＜0.01)。在100 μmol/L 時(shí)對(duì)16HBE 有明顯抑制作用(P＜0.05)(圖1)。

圖1 TSA 對(duì)A549 細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用Fig 1 The TSA has obvious effect on A549 cells

2.2 TSA 對(duì)A549 細(xì)胞遷移能力的影響

當(dāng)加入10 μmol/L 的TSA 后由于藥物的作用使細(xì)胞的遷移受抑制，而對(duì)照組未加TSA 的細(xì)胞保持了原有的遷移能力在一段時(shí)間后通過(guò)遷移將劃痕掩蓋(圖2)。

2.3 TSA 對(duì)EMT 相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

48 h 時(shí)與未加藥對(duì)照組比較，在10 μmol/L 給藥組其上皮細(xì)胞表型E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，而間質(zhì)表型Vimentin、Snail 及GSK-3β的表達(dá)均下調(diào)(P＜0.01)(圖3，表1)。

3 討論

研究證實(shí)，EMT 是轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期事件，有眾多基因及信號(hào)通路參與到EMT 的調(diào)控過(guò)程當(dāng)中［5-6］。EMT 除了促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲性增加，還誘導(dǎo)癌細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特點(diǎn)，如自我更新能力、增殖能力及抗拒凋亡的能力，并對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥等［7-8］。EMT 過(guò)程中上皮標(biāo)志物E-cadherin、ZO-1等表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Snail、Vimentin 及GSK-3β 等表達(dá)上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，突破基底膜最終形成遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移［2］。最近，表觀遺傳學(xué)在腫瘤研究領(lǐng)域正成為新的熱點(diǎn)。組蛋白乙酰乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histonedeacetyltransferases，HDACs)共同調(diào)控著真核細(xì)胞組蛋白乙?；乃?，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡。TSA 是研究得最為廣泛的組蛋白去乙?；敢种苿?。研究表明，TSA 可誘導(dǎo)P53 表達(dá)增高而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡［9］，并且TSA 聯(lián)合順鉑在體內(nèi)及體外明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖及遷移［10］。有關(guān)組蛋白與EMT 的作用關(guān)系已有部分報(bào)道。研究證實(shí)，HDAC1 的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致E-cadherin 啟動(dòng)子的活性減弱，而以轉(zhuǎn)染shRNA 的方法下調(diào)HDAC1 的表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，證實(shí)了HDAC1 與E-cadherin 的表達(dá)及EMT 的發(fā)生有關(guān)［11］。

圖2 TSA 對(duì)A549 細(xì)胞遷移能力的影響Fig 2 The TSA significantly inhibited migration ability of A549 cells

表1 不同濃度TSA 作用于A549 細(xì)胞48 h 后相對(duì)蛋白表達(dá)變化Table 1 Relative expression level of the protein by treated with different concentrations of TSA after 48 hours on A549 cells(±s，n=3)

表1 不同濃度TSA 作用于A549 細(xì)胞48 h 后相對(duì)蛋白表達(dá)變化Table 1 Relative expression level of the protein by treated with different concentrations of TSA after 48 hours on A549 cells(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control groups．

groupE-cadherin/β-actinSnail/β-actinVimentin/β-actinGSK-3β/β-actin control0.181 ±0.0111.034 ±0.0130.641 ±0.0050.720 ±0.001 0.10.316 ±0.0470.485 ±0.0060.605 ±0.0240.532 ±0.008 1 0.289 ±0.0230.476 ±0.0420.687 ±0.0310.511 ±0.004 100.865 ±0.015＊＊0.147 ±0.005＊＊0.081 ±0.007＊＊0.552 ±0.012*

圖3 TSA 對(duì)EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 3 EMT significantly inhibited by treatment of TSA

本研究發(fā)現(xiàn)TSA 對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 的抑制作用較明顯，而對(duì)16HBE 無(wú)明顯抑制作用，說(shuō)明TSA可針對(duì)性地抑制異常增殖的腫瘤細(xì)胞。劃痕實(shí)驗(yàn)表明，TSA 對(duì)A549 細(xì)胞的侵襲及遷移具有明顯的抑制作用，并且通過(guò)對(duì)EMT 相關(guān)蛋白的檢測(cè)，提示TSA 抑制A549 細(xì)胞的遷移可能是通過(guò)抑制其EMT途徑而實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果證實(shí)，TSA 通過(guò)抑制EMT 途徑抑制肺癌細(xì)胞的遷移，因此本研究對(duì)臨床治療肺癌提供了新的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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