甘草酸二胺對腹膜透析大鼠腹膜功能的影響

衛(wèi)志鋒，李 多，陸繼芳，劉圣君，李素敏

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 張家口 075000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

全世界目前擁有大約13萬腎臟病患者接受腹膜透析治療，但有近50%的患者在開始治療后的5年內(nèi)停止腹膜透析治療，其中腹膜纖維化引起的腹膜超濾衰竭是腹膜透析患者退出腹膜透析的主要原因。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在腹膜結(jié)構(gòu)和功能的改變中起著非常重要的作用，有研究[1]報(bào)道VEGF的上調(diào)參與了腹膜毛細(xì)血管的重塑。本研究探討甘草酸二胺對腹膜透析大鼠腹膜功能的影響，并檢測血液及透析液中VEGF的濃度，了解其是否與大鼠腹膜功能相關(guān)，旨在為今后的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物：選用雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量150～200g，由河北北方學(xué)院動(dòng)物室提供。飼養(yǎng)條件，一籠5只，每天光照12h，室溫保持24℃、相對濕度45%，大鼠的飲食及飲水在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不受限制。

1.2 藥品及試劑：4.25%腹膜透析液(廣州百特醫(yī)療用品有限公司)；己酮可可堿(武漢海特生物制藥股份有限公司)；甘草酸二胺(石家莊制藥集團(tuán)華盛制藥有限公司)；脂多糖(上海研生生化試劑有限公司)；大鼠VEGF ELISA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.3 分組與給藥：50只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為5組，即正常對照組、生理鹽水組、模型組、己酮可可堿治療組、甘草酸二胺治療組，每組10只?？瞻讓φ战M，不進(jìn)行任何處理；生理鹽水組，每日腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液20mL；模型組，每日腹腔內(nèi)注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)。己酮可可堿治療組，每日腹腔內(nèi)注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)+己酮可可堿6mg/kg。甘草酸二胺治療組，每日腹腔內(nèi)注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)+甘草酸二胺10mg/kg。實(shí)驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)4.25%腹膜透析液對實(shí)驗(yàn)大鼠有不良反應(yīng)。

1.4 標(biāo)本收集和觀察指標(biāo)：腹膜功能檢查，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30d后行2h腹膜平衡試驗(yàn)，10%水合氯醛麻醉大鼠，4.25%腹膜透析液25mL腹腔注射，留取0、4h腹膜透析液及血液標(biāo)本，注射4h后沿著腹白線處剪開腹膜，留取腹腔內(nèi)液體，準(zhǔn)確測量。血液標(biāo)本用5 000r/min的速度離心10min，腹透液標(biāo)本用1 500r/min的速度離心5min，留取腹膜透析液上清液、血清和血漿。超濾量=(最后出水量-25)mL,采用終點(diǎn)法測定透析液尿素濃度(Durea),血漿尿素濃度(Purea),初始腹膜透析液葡萄糖濃度(D0),2h透析液葡萄糖濃度(D4),計(jì)Durea/Purea和D4/D0。留取血液及腹膜透析液用ELISA法觀察VEGF濃度。各項(xiàng)數(shù)值為10只動(dòng)物的平均值。應(yīng)用全自動(dòng)血液分析儀檢測透出液的白細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類，超過1 000/mm3的大鼠,為發(fā)生腹膜炎,退出本次實(shí)驗(yàn)(模型組中發(fā)現(xiàn)2只大鼠出現(xiàn)腹膜炎，并退出實(shí)驗(yàn))。

1.5 檢測方法：將腹膜透析液標(biāo)本離心機(jī)中選1 500r/min速度離心10min，血液標(biāo)本選取3 000r/min速度離心15min。每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品0.1mL，標(biāo)準(zhǔn)品為用樣品稀釋液等倍稀釋成不同濃度的液體，37℃條件下反應(yīng)90min，移去液體，不洗。加入用抗體稀釋液稀釋的生物素抗大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1抗體，每孔0.1mL(1∶100)，37℃條件反應(yīng)60min，0.01mol/L PBS洗滌，加入稀釋液稀釋的親和素-過氧化物酶復(fù)合物，每孔0.1mL(1∶100)，37℃條件反應(yīng)30min，0.01mol/L PBS洗滌,每孔加入TMB顯色液0.1mL，反應(yīng)15min，每孔加入TMB終止液0.1mL。用酶標(biāo)儀在450nm測定OD值，零孔設(shè)為對照值，據(jù)各孔OD值計(jì)算待測VEGF的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 腹膜功能的改變：模型組超濾量及D4/D0較空白對照組和生理鹽水組明顯降低，Durea/Purea明顯升高(P<0.05)；己酮可可堿治療組和甘草酸治療組超濾量和D4/D0較模型組明顯升高，Durea/Purea明顯降低(P<0.05)。兩治療組以上指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1各組腹膜功能比較

組別只數(shù)超濾量(mL)Durea/PureaD4/D0空白對照組104.6±2.30.52±0.070.56±0.05生理鹽水組104.7±2.30.53±0.060.57±0.05模型組8-6.4±2.2?#0.88±0.11?#0.39±0.04?#己酮可可堿治療組10-2.7±2.0?#△0.67±0.09?#△0.48±0.02?#△甘草酸二胺治療組10-2.6±2.0?#△0.66±0.09?#△0.45±0.03?#△

*P<0.05與空白對照組比較 #P<0.05與生理鹽水組比較 △P<0.05與模型組比較(q檢驗(yàn))

2.2 ELISA法測定血清及腹透液中的VEGF表達(dá)：血清中的VEGF水平各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腹透液中空白對照組和生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組、己酮可可堿治療組、甘草酸二胺治療組透析液中VEGF的水平較空白對照組、生理鹽水組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且己酮可可堿治療組、甘草酸二胺治療組較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別只數(shù)VEGF血清腹膜透液 空白對照組10232.91±40.8733.31±9.33生理鹽水組10238.91±35.4032.31±6.09模型組8256.91±45.77132.45±23.67?#己酮可可堿治療組10247.77±34.3468.21±9.55?#△甘草酸二胺治療組10250.11±32.7870.34±8.94?#△

*P<0.05與空白對照組比較 #P<0.05與生理鹽水組比較 △P<0.05與模型組比較(q檢驗(yàn))

VEGF：vascular endothelial growth factor

3 討 論

腹膜透析與血液透析相比，腹膜透析能更好地保護(hù)殘余腎功能，并能更好地保護(hù)心血管系統(tǒng)穩(wěn)定性，臨床上常由于各種原因使腹膜透析患者退出腹膜透析治療，如腹膜透析液的生物不相容性、長期腹透引起透析相關(guān)性腹膜炎以及終末期腎臟病患者存在全身微炎癥狀態(tài)等導(dǎo)致腹膜纖維化[1]。炎癥包括由感染引起的急、慢性腹膜炎和終末期腎病患者的全身微炎癥狀態(tài)，兩者結(jié)合是腹膜纖維化的主要原因，最終導(dǎo)致超濾衰竭。新生血管增多是腹膜纖維化重要的病理機(jī)制之一，在超濾衰竭的發(fā)病機(jī)制中處于主導(dǎo)地位[2]。腹膜透析治療6年以上高達(dá)89%患者出現(xiàn)血管病變[3]。Yoko等[3]使用一種抗血管形成藥TNP-470,通過抑制實(shí)驗(yàn)大鼠血管及纖維母細(xì)胞的增生從而延緩大鼠腹膜纖維化。進(jìn)一步說明新生血管的形成在腹膜纖維化中起一定的作用。

己酮可可堿臨床上主要用于周圍血管疾病的治療，目前已有研究證實(shí)己酮可可堿有抗纖維化作用[4]，其能改善腹膜纖維化大鼠的腹膜透析效果。本研究利用己酮可可堿為藥物對照，觀察甘草酸二胺在腹膜纖維化中的作用。甘草酸二胺是中藥甘草有效成分的第3代提取物，具有較強(qiáng)的抗炎、保護(hù)細(xì)胞膜的作用，該藥在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與醛固酮的類固醇環(huán)相似，可阻礙可的松與醛固酮的滅活，從而發(fā)揮類固醇樣作用。王磊[5]研究表明甘草酸二胺對特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化有顯著的保護(hù)作用。

VEGF作為血管形成和致腹膜纖維化的主要因子，在腹膜新生血管形成和纖維化的過程中發(fā)揮各自的生物學(xué)作用，影響腹膜超濾[6-7]。Kyuden等[8]實(shí)驗(yàn)證明高糖能使人腹膜纖維化加重，應(yīng)用VEGF拮抗劑后腹膜纖維化減輕。有研究[9-10]表明可通過下調(diào)VEGF的表達(dá)，改善糖尿病腎病時(shí)腎小球毛細(xì)血管的通透性，緩解基膜增厚，減輕細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，延緩糖尿病腎病的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，血清中VEGF水平各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腹透液中空白對照組和生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組與空白對照組和生理鹽水組比較，VEGF明顯升高(P<0.05)，己酮可可堿治療組和甘草酸二胺治療組較模型組VEGF明顯降低(P<0.05)。表明己酮可可堿是治療腹膜纖維化比較成功的藥物，而甘草酸二胺與己酮可可堿比較，具有與其相當(dāng)?shù)寞熜АEGF水平在腹膜透析過程中升高，說明可能在腹膜纖維化過程中發(fā)揮作用，而且甘草酸二胺和己酮可可堿的干預(yù)作用可以減輕腹膜纖維化程度，其機(jī)制可能是通過降低VEGF水平來實(shí)現(xiàn)的。

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