8-異前列腺素F2α檢測方法研究進展

陳文，馬茹，梁若男，李成龍，余軒，王浩

（食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

8-異前列腺素F2α檢測方法研究進展

陳文，馬茹，梁若男，李成龍，余軒，王浩*

（食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

脂質(zhì)過氧化（Lipid peroxidation，簡稱LPO）與很多衰老現(xiàn)象和疾病密切相關(guān)，對于脂質(zhì)過氧化機理以及對其具有抑制功能的抗氧化劑的研究已成為食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的熱點。8-異前列腺素F2α（8-iso-prostaglandinF2α，簡稱8-iso-PGF2α）是細胞膜上酯化的花生四烯酸被自由基催化后裂解所形成的前列腺素衍生物，是目前公認評價脂質(zhì)過氧化反應的最有效生物標記物，因此，建立準確、可靠的8-iso-PGF2α的測定方法就顯得尤為重要。本文就脂質(zhì)過氧化、8-iso-PGF2α來源、標記功能等進行了概述，并對其測定方法進展進行了重點闡述，以期為該領(lǐng)域的研究工作提供參考。

8-異前列腺素F2α；測定方法；脂質(zhì)過氧化；抗氧化劑

脂質(zhì)過氧化是指脂類的多不飽和脂肪酸在自由基的引發(fā)下經(jīng)酶促或非酶促作用，使其發(fā)生過氧化而生成脂質(zhì)過氧化物的過程。目前國內(nèi)外關(guān)于脂質(zhì)過氧化、自由基損傷以及抗氧化劑的研究已成為食品、化妝品、生理學和流行病學等領(lǐng)域的熱點。研究結(jié)果表明，脂質(zhì)過氧化與很多衰老現(xiàn)象和疾病密切相關(guān)[1]。多不飽和脂肪酸在氧化過程中產(chǎn)生大量自由基和脂質(zhì)過氧化物，引起機體代謝紊亂，并導致DNA、RNA、蛋白質(zhì)、酶和生物膜的損傷，進而引發(fā)一系列疾病。據(jù)報道，目前危害人類健康的三大殺手——心血管、腦血管和癌癥，其發(fā)病機制均與自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應有著直接的關(guān)系。而抗氧化劑可有效清除生物體內(nèi)的自由基，進而起到保護人體細胞組織、心腦血管循環(huán)系統(tǒng)，抗癌及延緩衰老等生理作用。近年來，保健食品行業(yè)發(fā)展迅速，引起人們的廣泛重視。在食品中添加具有清除自由基作用的功效成分，可有效清除體內(nèi)的自由基，提高機體免疫力、抗衰老能力等，因此，脂質(zhì)過氧化機理的深入研究對于相關(guān)疾病的預防、診治以及篩選抗氧化保健食品功能材料，進而開發(fā)出具備抗氧化功能保健食品來抑制脂質(zhì)過氧化的負面作用具有重要意義。

對于脂質(zhì)過氧化機理的深入研究，首先要明確其狀態(tài)的評價方法。目前評價脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的方法一般可分為：脂質(zhì)過氧化底物的測定和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物兩類，后者的應用較為廣泛。脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一是丙二醛（MDA），在適當?shù)臈l件下，它可與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成一種紅色物質(zhì)，反應式見圖1，該物質(zhì)在532 nm處有一特征吸收[1]，據(jù)此可以測定MDA的含量，人們稱此法為TBA反應物法。該法可用來指示脂質(zhì)過氧化的程度[2]。

圖1 硫代巴比妥酸法原理Fig.1 The principle of TBA method

硫代巴比妥酸法成本低廉、設(shè)備要求低，易于推廣應用，因此，該法被廣泛用于測定氧化應激的標志物MDA的含量以評估脂質(zhì)過氧化的狀態(tài)[3-4]。但由于專一性不好、靈敏度差，且生物體系中基質(zhì)比較復雜，干擾物多，使得該法的應用受到嚴峻挑戰(zhàn)[5]。Morrow等[6]報道了F2-異前列腺素（F2-isoprostanes）這一類化合物，它具有類似前列腺素F2α的復雜基團。8-iso-PGF2α是F2-異前列腺素的主要成分。8-iso-PGF2α的化學性質(zhì)和產(chǎn)生過程均不易受外界環(huán)境的影響，是目前最新公認評價脂質(zhì)過氧化反應最有效的生物指標之一[7-9]。這為尋找簡捷、價廉、專一性好、靈敏度高及易于普及應用的方法進行脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的評價奠定了基礎(chǔ)。

1 8-iso-PGF2α概述

8-iso-PGF2α是自由基攻擊細胞膜脂質(zhì)花生四烯酸，使之發(fā)生過氧化反應后所形成的特異性終產(chǎn)物，其形成機制見圖2。

圖2 F2-異前列腺素的形成機制Fig.2 Mechanism of formation of F2-isoprostanes

1990年，Morrow等發(fā)現(xiàn)長期冷凍的血漿中8-iso-PGF2α的含量明顯增加，同時他們還證實該過程是非酶催化的自由基攻擊花生四烯酸的脂質(zhì)過氧化反應。這種化合物是前列腺素的異構(gòu)體，且均含有F型環(huán)戊烷，因此，被命名為F2-異前列腺素復合物（F2-ips）。根據(jù)F2-ips異構(gòu)位點的不同，可分為VI、IV、V和III型[10]。F2-ips通過還原反應大部分生成F2-ip，同時還生成異血栓素、E2-ip、D2-ip、D2異縮酮、E2異縮酮等[11]。在體內(nèi)F2-ips通過還原反應所形成的各種物質(zhì)中，F(xiàn)2-ip的含量最為豐富，它也可分為iPF2α-III、iPF2α-IV、iPF2α-V、iPF2α-VI 4個亞型[12]，其中iPF2α-III是最具代表性的F2-ip，也稱作8-iso-PGF2α或15-F2t-iP，其在F2-ip中所占的比例最大，存在于體液，如尿液、血液和腦脊液等以及肝、腦等組織中。

8-iso-PGF2α除具備諸如血管收縮劑、誘導內(nèi)皮素釋放和血管平滑肌細胞增殖、抗凝結(jié)以及介導炎癥早期反應等生物活性功能外[13-15]，其作為評估脂質(zhì)過氧化指標的功能更受到廣泛關(guān)注。8-iso-PGF2α是花生四烯酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應的特異性終產(chǎn)物，且生成途徑不依賴環(huán)氧化酶的催化，在機體組織上生成后釋放到血液中，最終通過尿液排出體外，從生成到排出的整個過程不易受到藥物或其他因素的影響[16]，因此，其在體液和機體組織中的含量非常穩(wěn)定，能特異、靈敏地反映機體脂質(zhì)過氧化的狀態(tài)，被認為是評價脂質(zhì)過氧化程度和損傷的最理想指標。

2 8-iso-PGF2α測定方法

8-iso-PGF2α以及其他F2-ip作為評價脂質(zhì)過氧化反應的標志物，無論是體液如血液、尿液和膽汁中[17-18]，還是大腦、肝臟和脈管系統(tǒng)[19-21]等組織中的8-iso-PGF2的含量均已通過各種方法進行了測定。8-iso-PGF2α自發(fā)現(xiàn)以來，其測定方法主要有以下幾種：

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定法（GC-MS）

GC-MS法是測量8-iso-PGF2α最常用、最成熟的方法，該法具備較高的靈敏度和準確度，曾被認為定量測定F2-ips的參考方法（金標準）。電噴霧離子化技術(shù)（ESI）與質(zhì)譜的結(jié)合大大提高了檢測方法的靈敏度，此外，GC-MS-MS方法的高靈敏度和特異性，完全可以通過僅提取少量機體的組織或體液來定量測定其中8-iso-PGF2α的含量，從而直接評估機體的脂質(zhì)過氧化情況。但該法對于樣品的凈化程度要求較高，一般需要通過固相萃?。╯olid phase extraction，簡稱SPE）或薄層色譜（TLC）來進行樣品的凈化。Liu Wei等通過C18SPE和SPE硅膠柱、薄層色譜技術(shù)來凈化樣品制備過程中的干擾基質(zhì)[22]。Mas等也利用C18SPE柱和氨基SPE柱來凈化尿液樣品[23]。Chu等則集樣品的凈化和提取于一步，僅使用十八烷基鍵合硅膠SPE柱來凈化血液樣品[24]，并利用配備DB-5MS毛細管柱的Agilent GC-MS在選擇離子模式下測定F2-異前列腺素的含量。因此，可以預見隨著SPE新型填料的不斷推出，SPE預處理樣品技術(shù)將變得更為簡便和高效。但是，對于GC-MS法測定8-iso-PGF2α來說，除了繁瑣的樣品預處理步驟外，還需要衍生化步驟、較高的設(shè)備要求以及需要專業(yè)人員進行操作都限制了該法推廣應用。

最初，Morrow和Roberts應用GC-MS法，采用商品化的同位素標記的前列腺素F2α（PGF2α）做內(nèi)標[25]測定了樣品中總F2-ips（酯化的和游離的）的含量。但由于前列腺素的同位素標記物和其異構(gòu)體的理化性質(zhì)不完全相同，因此用同位素標記前列腺素來測定F2-ips的含量是該法的一個缺陷。目前市場上已有同位素標記8-iso-PGF2α的內(nèi)標物出現(xiàn)，滿足了內(nèi)標物的要求。Liu Wei等以8-iso-PGF2α-d4為同位素內(nèi)標（Cayman Chemical，Cat.No.316351），以C18SPE和硅膠SPE柱、薄層色譜為樣品預處理技術(shù)，借助衍生化手段，應用GC-MS法測定了機體組織、血液和尿液中F2-ips的含量[22]，其GC-MS配備15m DB1701硅膠毛細管柱?？紤]到尿液中內(nèi)源性的化合物可能是同位素標記物8-iso-PGF2α-d4的共洗脫物，Mas等利用自己實驗室合成的4（RS）-F4t-neuroprostane作為內(nèi)標物，利用配備VF-1ms毛細管柱的GC-MS在NICI模式下測定了尿液中8-iso-PGF2α的含量[23]。該方法不但拓寬了GC-MS方法的應用范圍，而且為復雜樣品基質(zhì)中8-iso-PGF2α含量的測定提供了思路借鑒。

2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜測定法（LC-MS/MS）

該法的特點是靈敏度較高，對樣品的凈化步驟要求不嚴，預處理簡單、快捷，相對GC-MS法來說，又避免了繁瑣的衍生化步驟。此外，該法能夠同時測定多種異前列腺素，而免疫測定法每次只能測定一種。該方法也存在著靈敏度不如GC-MS的缺陷，但并不影響對于體液和組織中的8-iso-PGF2α含量的測定。

1996年，Murphy等報道首次使用該技術(shù)來測定異前列腺素的含量[26]，其主要儀器條件為：Ultracarb品牌的ODS 5μm，4.6 mm×25 cm分離柱，流動相為pH5.7的氫氧化銨和乙腈：甲醇（95∶5，體積比），配備三重四級桿MS進行目標物離子的監(jiān)測。Taylor[27]等通過將SPE和液液萃取相結(jié)合，對傳統(tǒng)的液液萃取方法進行了改進，同時他們還縮短了液相的分離時間以得到較高的峰高，兩方面的改進提高了該法的靈敏度，最終測定了血漿中總15-series F2-isoprostanes的含量。Sicilia[28]等充分發(fā)揮該法對樣品凈化要求不嚴的優(yōu)勢，利用該法測定了CCl4所引發(fā)的脂質(zhì)過氧化小鼠肝臟、腎臟和尿液中8-iso-PGF2α含量，為復雜生物基質(zhì)樣品中8-iso-PGF2α含量的測定提供了方法借鑒。近年來該法的應用次數(shù)呈快速增長的趨勢[29-30]。可見，LCMS/MS是一種具備較好發(fā)展前景的檢測技術(shù)。

2.3 免疫親和色譜-氣質(zhì)聯(lián)用測定法（Immuno-GC-MS）

免疫親和色譜是利用抗體或者與抗體相關(guān)的材料作為固定相的色譜技術(shù)?？贵w對抗原性物質(zhì)的選擇性結(jié)合使該技術(shù)越來越多地應用于生物物質(zhì)以及非生物物質(zhì)的分離、純化和分析。其與GC-MS結(jié)合來測定8-iso-PGF2α含量的方法稱為免疫親和色譜-氣質(zhì)聯(lián)用測定法。該法主要應用免疫親和柱的凈化作用和質(zhì)譜的定量功能進行測定，其優(yōu)點是免疫親和柱可以重復利用，并可以代替所有的凈化程序，但免疫親和柱的壽命有限，需要不斷地添加抗體。其一般測定程序是首先將待測樣品通過免疫親和色譜柱，其中待測目標物以及類似物與柱中的抗體結(jié)合，不與抗體結(jié)合的其他樣品組分通過淋洗被除去。最后，將結(jié)合在固定相上的的待測目標物洗脫下來進GC-MS檢測。Bachi等應用該方法測定了尿液中8-epi-prostaglandin F2α的含量[31]。

2.4 免疫測定法

免疫測定法（Enzyme Immunoassay，簡稱EIA）也稱作酶聯(lián)免疫測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA）。與GC-MS法相比，該法簡單、快速，不需專業(yè)人員操作。但該技術(shù)也存在著多種缺陷：一是準確性不好，在測定樣品中8-iso-PGF2α之前，要對樣品進行繁瑣的純化操作，這樣不但費時，而且可能造成目標物的流失，導致低回收率；二是特異性差，可能發(fā)生交叉免疫反應，因為針對8-iso-PGF2α制備的抗體也可能與其他的異構(gòu)體或其代謝產(chǎn)物發(fā)生交叉反應；三是結(jié)果誤差大，在測定過程，尤其是在8-iso-PGF2α與抗體充分結(jié)合期間，樣品中8-iso-PGF2α相關(guān)前體可以繼續(xù)合成目標物，導致結(jié)果偏大。

目前，主要是基于該法的原理制備ELISA檢測試劑盒，將其用于體內(nèi)和體外8-iso-PGF2α的初步檢測。在制備ELISA檢測試劑盒用于8-iso-PGF2α測定時，利用GC-MS法進行了對比驗證，但是并不意味著對于其他類型的異前列腺素及其代謝物也能夠準確測定?？傊?，該法相對GC-MS法的優(yōu)點是操作簡單、不需要貴重儀器、成本較低和省時省力等。因此，可將該法用于對8-iso-PGF2α的含量的初檢，如有必要再次通過GC-MS法進行驗證，這種特點使其在醫(yī)院中相關(guān)疾病的診斷和治療方面應用較多。目前，用于8-iso-PGF2α檢測的商業(yè)化試劑盒有北京西美杰科技有限公司推薦的OxiSelectTM8-iso-Prostaglandin F2αELISA Kit（8-isoprostane）試劑盒（目錄號：STA-337），該試劑盒通過競爭性ELISA檢測胞漿、尿液、血漿以及組織提取液等多種樣品內(nèi)的8-iso-PGF2α含量。在試劑盒中，還提供了8-iso-PGF2α標準樣做標準曲線，并有相應的8-iso-PGF2α抗體和競爭性8-iso-PGF2α-HRP等。樣品經(jīng)ELISA反應后可在450 nm處讀取數(shù)據(jù)并參照標準曲線計算出含量。該Kit可完成96次反應，操作簡便、速度快。

3 結(jié)語

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和自由基能引起機體代謝紊亂，損傷DNA、RNA、蛋白質(zhì)、酶和生物膜，并導致一系列疾病的發(fā)生。補充適當?shù)耐庠纯寡趸瘎┛捎行Ы档突蚍乐惯^氧化所導致的氧化損傷的發(fā)生，維持機體平衡和健康。抗氧化劑可分為兩種：合成抗氧化劑和天然抗氧化劑。前者主要是二丁基羥基甲苯和丁基羥基茴香醚等，其生產(chǎn)工藝復雜，且有毒副作用，這些缺陷限制了其應用范圍。天然抗氧化劑一般來源于植物，具有高效、低毒和功能齊全的優(yōu)勢，能夠有效清除自由基、抑制過氧化，使氧化與抗氧化系統(tǒng)維持在平衡狀態(tài)，是當前研究開發(fā)的重點?？寡趸瘎┛寡趸芰Φ脑u價方法有體內(nèi)和體外抗氧化能力檢測兩種。建立脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的客觀評價方法，有助于對其機理的深入研究，不但可以指導如何有效規(guī)避脂質(zhì)過氧反應帶來的負面效應，而且可以作為評估抗氧化劑的效果的重要手段。脂質(zhì)過氧化程度的檢測方法除了常用的TBA反應物法測定MDA之外，本文綜述了另一種方法，即通過測8-iso-PGF2α的含量來特異、穩(wěn)定地反映脂質(zhì)過氧化的程度。

8-iso-PGF2α作為脂質(zhì)過氧反應的特異性穩(wěn)定產(chǎn)物，是目前公認評價脂質(zhì)過氧化反應狀態(tài)的最有效生物指標。在8-iso-PGF2α的測定方法中，GC-MS法、LCMS/MS法、Immuno-GC-MS法和EIA法均有優(yōu)勢和不足，可根據(jù)實際情況進行選擇。目前存在的問題是國內(nèi)外沒有針對8-iso-PGF2含量測定的統(tǒng)一的方法，不同方法之間的測定結(jié)果差距較大，導致測定結(jié)果難以對比。因此，建立一個公眾認可的8-iso-PGF2α測定方法，顯得較為迫切，也是下一步相關(guān)領(lǐng)域研究的重點和突破口。隨著科技的不斷發(fā)展，各種高新技術(shù)不斷地應用于樣品的預處理，這將會大大簡化樣品制備程序，提高檢測結(jié)果的準確度和靈敏度，同時也將為建立公認的8-iso-PGF2α含量的測定方法提供技術(shù)支持。

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The Research Progress about Test Methods of 8-iso-prostaglandin F2α

CHEN Wen，MA Ru，LIANG Ruo-nan，LI Cheng-long，YU Xuan，WANG Hao*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Lipid peroxidation have close relationship with a lot of aging and disease，the study of mechanism of LPO and the antioxidant which have an inhibitory effect on，LPO has became a hat spot in food and medicine，et al.8-iso-PGF2αis a Prostaglandins derivative which is formed by pyrolysis of the esterification of arachidonic acid on the cell membrane.8-iso-PGF2αis currently recognized as one of the most effective biomarkers for the evaluation of LPO.Hence，the development of accurate and reliable method for the determination of 8-iso-PGF2αis very critical.LPO，the origin and function as a biomarker of 8-iso-PGF2αwere summarized in this article. Furthermore，the assay method for8-iso-PGF2αwere also highlighted reviewed so as to provide reference for the research work in this field.

8-iso-prostagland in F2α；assay method；Lipid peroxidation；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.031

2013-07-20

國家自然科學基金（31201322）；“十二五”國家科技計劃（2012BAD33B05）；天津市高等學?？萍及l(fā)展基金計劃（20100609）

陳文（1984—），男（漢），助理工程師，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。

*通信作者：王浩（1979—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)學。