高效液相色譜法測定左乙拉西坦血藥濃度

周春華，張志清* ，何文娟，李敬瑄，吳亞敏

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

左乙拉西坦(levetiracetam)是吡拉西坦衍生物中的左旋乙基吡拉西坦，其化學(xué)名稱為(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，分子式為C18H14N2O2[1-2]。左乙拉西坦是一種新型的抗癲癇藥，其結(jié)構(gòu)和抗癲癇的機制與其他藥物不同，主要是選擇性地抑制癲癇樣突發(fā)放電的超同步性和癲癇發(fā)作的傳播而發(fā)揮作用，2007年引入中國，用于治療癲癇的部分發(fā)作、原發(fā)性或繼發(fā)性全身發(fā)作[3-5]。左乙拉西坦口服幾乎可以完全吸收，進食可減慢其吸收速度，但不影響其吸收程度[6]。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑：左乙拉西坦對照品(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，純度>99%，批號404809001)，替硝唑?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，純度>99%，批號100336-200402)，磷酸(分析純，石家莊化工廠，批號19981116)，乙腈(色譜純天津市康科德科技有限公司，批號101203)，乙酸乙酯(分析純，天津市北辰馬華躍化學(xué)試劑廠，批號20050718)，蒸餾水(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院自制)。

1.2 儀器：高效液相色譜儀，Waters 515泵，486色譜檢測器，操作平臺Empower Application；電子天平(FA2104，上海良平精密儀器廠)；冰箱(日本三洋，型號MDF-U2086S)；離心機(北京醫(yī)用離心機廠，LD5-10)；渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠，XW-80A)；數(shù)控恒溫水浴(北京康林科技有限責(zé)任公司，氮吹儀專用，KL512J)；抽濾泵(天津市協(xié)同儀器有限公司)；超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 色譜條件：色譜柱，Diamonsil C18(250×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈∶0.4%磷酸溶液=20∶80(V/V)；檢測波長210nm；柱溫35℃；進樣量20μL[7]；流速1.0mL/min；內(nèi)標(biāo)為替硝唑。

2 方法與結(jié)果

2.1 模擬生物樣品處理方法：取血清180μL于10mL塑料離心管中，加左乙拉西坦(系列濃度)20μL和內(nèi)標(biāo)(200mg/L)50μL，混勻，加乙酸乙酯3mL，渦旋，離心，取2.5mL上清液于5mL玻璃離心管中，50℃水浴，氮氣流吹干，100μL甲醇復(fù)溶，進樣。

2.2 溶液的配制：儲備液的制備，精密稱取左乙拉西坦50mg，溶于50mL量瓶中，用甲醇溶解定容，得1g/L的左乙拉西坦溶液作為母液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備，取儲備液適量于25mL的量瓶中，分別用甲醇稀釋成10、25、50、200、400、800mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；再取800mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液適量于25mL的量瓶中，甲醇稀釋成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液的制備，精密稱取替硝唑?qū)φ掌芳s20mg置100mL量瓶中，甲醇稀釋定容，得200mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 專屬性考察：在選定的色譜條件下，內(nèi)標(biāo)與藥物完全分離，藥物保留時間為4.3min，內(nèi)標(biāo)保留時間為8.4min，出峰時間均在10min之內(nèi)，且血清中的內(nèi)源性物質(zhì)對其無干擾，見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取血清常溫融化，精密吸取180μL于10mL塑料離心管中,加系列濃度的左乙拉西坦溶液20μL，加內(nèi)標(biāo)50μL，配成血清中左乙拉西坦?jié)舛纫来螢?、2.5、5、10、20、40、80mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入提取劑(乙酸乙酯)3mL，渦旋混合2min，4 000r/min離心5min，取上清液2.5mL于5mL

玻璃離心管中，50℃水浴，氮氣流吹干，100μL甲醇復(fù)溶，進樣。以藥物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值對藥物濃度進行線性回歸得線性回歸方程Y=0.096 4X+0.017 2(r=0.999 1)，線性范圍1～80mg/L。

圖1 高效液相色譜圖

A.空白血清；B.血清模擬樣品；C.給藥后血清樣品；1.左乙拉西坦；2.內(nèi)標(biāo)

Figure 1 HPLC chromatograms

A.Blank serum;B.Blank serum with levetiracetam and tinidazole;C.Serum sample;1.Levetiracetam;2.Tinidazole

2.5 回收率

2.5.1 提取回收率：配制左乙拉西坦血清濃度分別為2.5、10、40mg/L的模擬血清生物樣品，并按“2.1”項下處理方法處理，進樣，測定藥物峰面積S血藥。另取濃度分別為2.5、10、40mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吹干，100μL甲醇復(fù)溶后直接進樣測定藥物峰面積S純藥。取180μL血清加100mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液50μL，其余按血清生物樣品處理方法處理，測定峰面積S血清內(nèi)標(biāo)。另取濃度為100mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，吹干，100μL甲醇復(fù)溶后進樣測定峰面積S純內(nèi)標(biāo)。左乙拉西坦與內(nèi)標(biāo)的提取回收率。見表1。

2.5.2 方法回收率：配制左乙拉西坦血清濃度分別為2.5、10、40mg/L的血清模擬生物樣品各5份，并按“2.1”項下處理方法處理，測得峰面積比值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到濃度，利用該濃度與加入濃度的比值計算方法回收率。見表1。

2.6 精密度：配制高、中、低濃度分別為2.5、10、40mg/L的模擬血清樣品，均按“2.1”處理方法處理，日內(nèi)連續(xù)測定高、中、低各5組的峰面積，得到峰面積比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算日內(nèi)精密度；日間連續(xù)5d測定高、中、低3個濃度的模擬生物樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算日間精密度。見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果Table 1 Results of recovery and precision test (n=5，%)

LEV：levetiracetam；RSD：relative standard deviation

2.7 穩(wěn)定性考察：取180μL血清于10mL塑料離心管中，加100mg/L的左乙拉西坦溶液20μL，分別考察-40℃冰箱放置5d穩(wěn)定性、反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性和處理樣品室溫放置4h穩(wěn)定性。見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Results of stability test (n=5,%)

LEV：levetiracetam；RSD：relative standard deviation

2.8 臨床應(yīng)用：本法可用于臨床患者血清中藥物濃度的測定。

3 討 論

內(nèi)標(biāo)選擇曾考慮過以拉莫三嗪、奧卡西平，并依次在254、210、220、240nm波長處測定其出峰時間和峰面積，但都由于最大吸收波長與藥物最大吸收波長不接近而導(dǎo)致在以上波長條件下吸收過小，并最終選定替硝唑為內(nèi)標(biāo)，選用該內(nèi)標(biāo)具有雜質(zhì)干擾少、保留時間適宜等優(yōu)點。

分離提取時先采用乙酸乙酯和二氯甲烷2種溶劑分別作為提取劑，雖然二氯甲烷[8]提取不易出現(xiàn)乳化，但通過比較兩者提取后雜質(zhì)峰的干擾程度，最終采用乙酸乙酯，采用乙酸乙酯提取使提取率較高而且穩(wěn)定，各濃度提取率的平均相對偏差均小于10%。

根據(jù)查閱的文獻[9-10]初步確定選用0.4%磷酸溶液和乙腈的混合溶液為流動相并最終確定乙腈∶0.4%磷酸溶液=20∶80(V/V)作為流動相，該流動相可使血清中的雜質(zhì)，藥物和內(nèi)標(biāo)的到很好的分離。

本實驗方法中對左乙拉西坦血清樣品2.5、10、40mg/L 3個濃度做了日內(nèi)、日間精密度的測定，分別算出平均值、標(biāo)準(zhǔn)差。由數(shù)據(jù)可知,左乙拉西坦日內(nèi)、日間精密度RSD均在規(guī)定范圍內(nèi)，因此本實驗方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能夠用于血藥濃度測定。

試驗中我們還發(fā)現(xiàn)含左乙拉西坦的血清在-40℃低溫保存和反復(fù)凍融時，血藥濃度基本不變。從而保證實驗方法的可行性，為今后的研究工作提供了方法和依據(jù)。

[1] 王剛,張君梅,易曉燕,等.高效液相色譜法測定癲癇患兒血清中左乙拉西坦的濃度[J].中國新藥與臨床雜志,2011,30(6):476-480.

[2] 薛娜，周春華，張愷，等.左乙拉西坦的合成[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013,34(9):1048-1050.

[3] 劉騰，趙志剛.左乙拉西坦的藥理和臨床評價[J].中國新藥雜志,2007,9(16):733-735.

[4] 李慧芬，張玉琴，劉彥.HPLC法測定人血清中左乙拉西坦的濃度[J].中國藥房，2013,14(24):1271-1273.

[5] ENGEL J JR.International League Against Epilepsy (ILAE).A proposed diagnostic scheme for people with epileptic seizures and with epilepsy:report of the ILAE task force on classification and terminologyngel[J].Epilepsia,2001,42(6):796-803.

[6] 丁慶明，任連坤.抗癲癇新藥左乙拉西坦的臨床應(yīng)用和安全性[J].藥物不良反應(yīng)雜志,2007,9(4):295-301.

[7] 趙潤,肖曉蕓.左乙拉西坦治療小兒癲癇研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2011,23(27):3586-3587.

[8] 王穎慧,魏敏吉，王云秀,等.高效液相色譜法測定左乙拉西坦血藥濃度[J].兒科藥學(xué)雜志,2010,16(4):237-239.

[9] 肖擁軍，羅湘冀.高效液相色譜法測定左乙拉西坦片的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2005,21(7):687-688.

[10] 李琳琳，宋新文，汪洋，等.固相萃取高效液相色譜法測定左乙拉西坦[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2012,4(28):289-291.