有氧運動通過上調(diào)IGF1改善抑郁癥大鼠的學習記憶能力

劉紅軍，呂毓虎

(四川民族學院，四川康定 626001)

慢性應激誘發(fā)的抑郁癥是一種常見的精神疾病，全球發(fā)病率為3.1%，發(fā)達國家接近6%，我國為3% ～5%，特別在我國大中城市呈高發(fā)和逐年遞增趨勢。目前認為抑郁癥發(fā)病機理主要歸納為:突觸間單胺類遞質(zhì)(如5－羥色胺)異常減少，谷氨酸受體等多種神經(jīng)遞質(zhì)直接相互作用異常，神經(jīng)內(nèi)分泌異常以及海馬神經(jīng)元的凋亡受損等［1－2］。而運動作為一種可促進機體心理健康的刺激因素，在維持或代償受損神經(jīng)功能方面的作用已被越來越多的研究證實。有研究顯示體育鍛煉不僅可通過誘導海馬齒狀回區(qū)域神經(jīng)元細胞數(shù)量增殖，還可增加神經(jīng)元細胞活性從而有效減少臨床及實驗動物抑郁癥的發(fā)生，相反的，應激和抑郁等因素可抑制海馬神經(jīng)元生成［2－4］。另外，也有研究顯示對處于不可預期應激條件下和瀕臨抑郁的大鼠，長期鍛煉有助于減少它們出現(xiàn)抑郁典型行為的機率［5］。目前關于有氧運動可緩解抑郁癥及改善機體認知記憶能力潛在的分子信號機制已成為運動醫(yī)學的研究熱點之一?；蛐酒夹g是針對目前大量遺傳信息進行高效、快速檢測及分析之要求發(fā)展而來的一門先進分子生物學實驗技術。其已廣泛用于疾病診斷和治療、藥物篩選、食品衛(wèi)生監(jiān)督等許多領域。本實驗采用基因芯片篩選有氧運動組及其對照組大鼠的差異表達基因和富集通路，為初步篩選靶基因及靶信號通路提供理論依據(jù)，為研究有氧耐力運動改善抑郁癥及機體記憶學習能力的分子生物學機制研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 慢性應激誘發(fā)抑郁癥動物模型建立

由中山大學實驗動物中心購買30只，清潔級，平均體重約250g～300g克雄性SD大鼠。實驗動物首先進行一周適應性喂養(yǎng)，期間自由飲水，晝夜時間分別為12/12h交替。保持動物室溫度22℃ ～25℃，濕度為55% ～75%。隨后將SD大鼠隨機分為正常組(C)和模型組(M)。采用晝夜節(jié)律的調(diào)整和光照性質(zhì)的改變(閃光刺激、晝夜顛倒、黑白交替、間斷光照)食物和飲水供應的調(diào)整(禁食、水)，居住環(huán)境的改變(單籠飼養(yǎng)、鼠籠傾斜)，電擊足底，驚恐刺激(噪聲)，氣味刺激及4℃游泳冷刺激作為應激源。每天隨機選取兩種應激源作用于模型組，為期4周。對照組合籠飼養(yǎng)且無應激源刺激。觀察抑郁癥模型建立的行為指標是大鼠體重變化，食物消耗量，學習記憶和空間探索能力。

1.2 有氧耐力運動動物模型建立

將成功建立抑郁癥模型的SD大鼠(20只)隨機分為抑郁安靜組(Con)及抑郁有氧運動組(ET)，有氧運動組進行為期一周適應性訓練。之后進行為期4周，12m/min(強度相當于75%VO2max)的有氧跑臺訓練，60min/次，5 次/周［6］。抑郁安靜組的大鼠籠內(nèi)自由活動作為對照。

1.3 水迷宮實驗

用Morris水迷宮測定小鼠空間學習記憶的能力.抑郁癥模型建立及游泳訓練結(jié)束時需要進行該實驗。游泳槽為自制泳槽:1.5m×0.3m×0.6m，水溫28℃ ±2℃。游泳槽等分為A、B、C及D四個象限，在壁上標上東南西北四個入水點，分別以四種不同形狀的圖形作為標記，在D象限正中離池壁30 cm處放一個直徑為9cm，高38cm的圓形平臺，平臺頂?shù)陀谒?cm。水迷宮上方安裝攝像機，訓練期間水迷宮外參照物保持不變。每次訓練隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水池，同一次訓練所有大鼠入水點相同。每只大鼠在訓練前放于平臺60s以熟悉水迷宮及周圍環(huán)境。記錄大鼠找到平臺的時間，即潛伏期(latency)。至60s找不到平臺，則將其引上平臺，潛伏期記為60s，大鼠每次爬上平臺或被引上平臺后，讓其在平臺上休息30s。每天四次訓練，取四次潛伏期的算術平均值。

1.4 空間探索實驗

空間探索實驗(spatial probe test)用于評價動物對經(jīng)驗的記憶能力，即動物學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的能力。本研究在抑郁癥模型建立及游泳訓練結(jié)束后需要進行該實驗。訓練的最后時段撤除平臺，然后在B象限任選一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，觀測其在60s內(nèi)穿越各象限平臺相應位置(即平臺在D象限所在的位置)的次數(shù)。

1.5 海馬樣本留取

4周有氧游泳訓練結(jié)束后，將SD大鼠禁食14h～16h。根據(jù)個體體重實施麻醉，隨后冰上立即分離海馬入EP管，并迅速置于液氮中速凍，后于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 基因芯片實驗

每組取部分海馬組織樣本送于北京博奧生物芯片有限公司進行基因芯片實驗。選用SAM軟件(博奧生物芯片有限公司)篩選差異表達基因。差異表達基因是指表達上調(diào)和下調(diào)的基因，篩選標準為q－value(%)小于5%，同時差異倍數(shù)(Fold Change)大于 1.5倍(即 Fold Change≥1.5或 Fold Change≤0.667)。運用博奧生物晶芯?生物分子功能注釋系統(tǒng) V4.0(Capital Bio Molecule Annotation System V4.0)對數(shù)據(jù)進行Pathway統(tǒng)計學分析。

1.7 Real－time qPCR實驗

隨機選擇6個差異表達基因，選用IQ5實時定量PCR儀進行Real－time qPCR反應以驗證基因芯片實驗結(jié)果。反應體系如下:SYBR Green(10μl)，5’Primer(0.5μl)，3’Primer(0.5μl)，cDNA(3μl)，ddH2O(6μl)。將其混合均勻，離心后放入PCR儀中進行擴增反應。程序為94°C 2min，40個循環(huán)反應，65°C 30s，95°C 30s。其中循環(huán)反應的程序為 94°C 30s，目的基因退火溫度 30s，72°C 1min。GAPDH作為內(nèi)參基因。所選基因及其引物序列詳見表1。

1.8 Western Blot實驗

選用液氮研磨法提取海馬組織總蛋白;隨后進行SDSPAGE凝膠電泳，總蛋白上樣量約80μg，電泳條件為:60V，30 min;隨后110V，2 hours;采用濕法電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)印條件為:4°C，300 mA，2 hours;用含有 5% 脫脂奶粉的封閉液封閉 1 hour;一抗 IGF，ERK及CREB稀釋比例為 1:2000、1:4000和1:2000，4°C孵育過夜;二抗稀釋比例為1:10000，室溫孵育 1小時;加 ECL－Plus發(fā)光底物，于暗室曝光，膠片顯影和定影。β－tubulin作為內(nèi)參蛋白。掃描圖片后用蛋白質(zhì)定量分析軟件統(tǒng)計。

表1 Real－time qPCR引物序列

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)由SPSS11.5 for Windows處理。數(shù)據(jù)采用單因素方差(One－Way ANOVA)分析。各組間差異性檢驗的顯著性水平定為 P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SD大鼠抑郁癥模型結(jié)果分析

正常組及模型組在建模前體重無差異。經(jīng)過4周慢性應激刺激后，較正常組，模型組大鼠體重及食物消耗量顯著降低(a，b)。另，水迷宮實驗和空間探索實驗結(jié)果顯示，較正常組，模型組大鼠發(fā)現(xiàn)平臺的潛伏期顯著延長(c)，而1min找到平臺的次數(shù)顯著減少(d)，表明模型組大鼠的學習記憶及空間探索能力顯著降低。以上結(jié)果提示慢性應激可成功誘導大鼠抑郁癥的發(fā)生(圖1)。

圖1 大鼠的食物消耗量、體重變化，發(fā)現(xiàn)平臺的潛伏期及次數(shù)

2.2 有氧運動后學習記憶及空間探索能力

4周有氧跑臺訓練結(jié)束后，比較抑郁安靜組(Con)和抑郁有氧運動組(ET)大鼠的學習記憶及空間探索能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水迷宮實驗ET大鼠中找到平臺的時間顯著低于Con組(a)，而空間探索實驗組中，1min內(nèi)，ET大鼠中找到平臺的次數(shù)顯著高于Con組(b)。以上結(jié)果表明4周有氧跑臺訓練可顯著提高抑郁癥大鼠的學習記憶和空間探索能力(圖2)。

圖2 大鼠發(fā)現(xiàn)平臺的潛伏期及次數(shù)

2.3 基因芯片結(jié)果

采用博奧公司提供的SAM軟件篩選Con組和ET組小鼠腓腸肌差異表達基因。經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)366個差異表達基因，其中表達上調(diào)基因332個，表達下調(diào)基因34個。對照兩組的信號強度，可直觀觀察樣品間基因表達的差異情況。一個熒光點代表基因芯片上一個基因的雜交信號，紅色標記和綠色熒光點分別表示表達有差異的基因，而黑色標記點代表基因表達無顯著性差異(圖3)。

圖3 比較分析散點

Pathway統(tǒng)計法可初步篩選差異表達基因密切相關的信號通路，為更準確定位靶信號通路及靶基因提供基礎理論依據(jù)。采用Pathway分類統(tǒng)計法分析Con和ET組差異表達基因，結(jié)果顯示兩組差異表達基因所編碼的蛋白共涉及61條信號通路。信號通路的P－value值代表差異表達基因與該信號通路的相關性，其越小表示相關度越大(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組差異表達基因與IGF1信號通路密切相關(P－value=0.009083)。

表2 差異表達基因按照KEGG數(shù)據(jù)庫Pathway分類

2.4 Real－time qPCR結(jié)果

如圖4所示，基因芯片結(jié)果與Real－time qPCR結(jié)果一致。提示本實驗中基因芯片結(jié)果假陽性率低，具有可靠性。

2.5 Western Blot結(jié)果

由于基因芯片結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)抑郁安靜對照組(Con)及抑郁有氧運動組(ET)大鼠差異表達基因富集通路包含IGF1信號通路，因此本實驗進一步檢測IGF1信號通路相關蛋白表達的變化。4周有氧跑臺訓練后，取Con及ET兩組大鼠的海馬組織提取總蛋白進行Western Blot實驗，以檢測運動對抑郁癥大鼠IGF1，ERK和CREB蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，ET組大鼠的海馬組織中IGF1，ERK和CREB3種蛋白表達均顯著增加(圖5)。

圖5 海馬組織中IGF1，ERK和CREB蛋白表達變化

3 討論

鑒于海馬是機體成年后神經(jīng)發(fā)育的主要結(jié)構，在后天情緒調(diào)節(jié)，技能學習和記憶中發(fā)揮重要作用。目前隨著生物技術的進步，研究采用腦影像學發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的大腦結(jié)構會產(chǎn)生明顯的形態(tài)學變化，這種變化在海馬中更為顯著［4－5］。且海馬參與抑制下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)軸(H PA軸)，與慢性應激和衰老發(fā)生密切相關;海馬的投射纖維與多個情感相關腦區(qū)密切相連;海馬富含谷氨酸——參與抑郁癥發(fā)病最重要的一種神經(jīng)遞質(zhì);因此海馬已經(jīng)成為研究和治療抑郁癥的主要腦區(qū)［7－8］。而且目前有氧運動可促進抑郁癥機體心理健康，改善其認知功能和學習能力已經(jīng)成為一個不爭的事實。而關于運動可能增加神經(jīng)營養(yǎng)因子表達從而營養(yǎng)神經(jīng)元而治療抑郁癥的假說也得到了很多研究者的關注。本研究正是基于此假說，采用基因芯片高通量篩選海馬組織中抑郁后有氧運動其對照安靜組直接的差異基因和相關信號通路，意在探索抑郁癥的發(fā)病機制及臨床治療的靶點。

本研究中大鼠體重，食物消耗量，學習記憶能力及空間探索能力四項指標顯示，28天慢性應激可成功誘導大鼠抑郁癥的發(fā)生。隨后對抑郁癥大鼠進行運動訓練干預，意在探究運動抵抗抑郁發(fā)生的潛在分子生物學機制。經(jīng)過4周有氧跑臺訓練后，發(fā)現(xiàn)ET組大鼠的學習記憶和空間探索能力顯著高于其安靜對照組;提取Con和ET組海馬組織進行基因芯片實驗發(fā)現(xiàn)兩組的差異表達基因富集通路含有IGF1信號通路，提示有氧運動改善抑郁癥大鼠的學習記憶及空間探索能力可能與IGF1信號通路密切相關。因此檢測IGF1信號通路相關信號分子的蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有氧運動可顯著增加 IGF1，ERK及CREB蛋白的表達，認為這3個因子在運動治療抑郁癥及改善機體學習記憶和空間探索能力中發(fā)揮關鍵作用。

多項研究證實，應激和抑郁可降低IGF1表達，而在抑郁癥治療過程中發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)IGF1水平升高［8－9］;將IGF1直接注射到大鼠側(cè)腦室可阻礙抑郁的發(fā)生，而皮下注射IGF1也促進海馬齒狀回區(qū)域神經(jīng)元的發(fā)生［10－11］;另外，有研究發(fā)現(xiàn)跑臺或跑轉(zhuǎn)輪運動可促進外周IGF1進入大鼠海馬區(qū)被特定神經(jīng)元吸收，降低抑郁癥對實驗動物認知功能及海馬細胞增殖的損害作用［12］。ERK作為神經(jīng)細胞內(nèi)重要的信號通路之一與抑郁癥的發(fā)生密切相關。對自殺的抑郁患者尸檢分析發(fā)現(xiàn)，ERK的活性與表達均降低，而使用多種抗抑郁藥研究中發(fā)現(xiàn)海馬ERK水平增高，運動可以產(chǎn)生類抑郁藥作用，提高海馬MAPK/ERK的磷酸化水平［13－14］。CREB是一種細胞核內(nèi)調(diào)控因子，又被稱為轉(zhuǎn)錄增強因子，通過自身磷酸化實現(xiàn)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能。CREB能夠?qū)Φ鞍准っ?A(protein kinase A，PKA)、MAPK/ERK、PI3K及IGF1等信號通路調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，應激或抑郁會抑制CREB的活動，而抑郁治療能夠提高其水平，因此 CREB可能是影響抗抑郁作用的關鍵因子［15－17］;另有研究發(fā)現(xiàn)，運動可以提高海馬CREB mRNA及磷酸化水平增加，同時MAPK/ERK的磷酸化水平也持續(xù)升高［18－19］。由此可見，IGF1，ERK及CREB因子通過發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用促進海馬神經(jīng)元細胞增殖及活性抵抗機體抑郁的發(fā)生，緩解抑郁發(fā)生時機體學習記憶及空間探索能力的降低，而有氧運動恰可以增加3種因子在海馬組織中的表達。

4 結(jié)論

4周有氧跑臺訓練通過調(diào)控IGF1信號通路相關分子促進機體記憶學習記憶及空間探索能力的提高。且基因芯片發(fā)現(xiàn)4周有氧跑臺訓練可引起抑郁癥SD大鼠海馬組織全基因表達譜發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)新運動敏感基因和信號通路。該技術將在運動醫(yī)學研究領域中發(fā)揮顯著作用，為探究運動治療抑郁癥等疾病分子生物學機制研究提供理論支持和幫助。

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