超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定乳及乳制品中AFM1、AFM2

李佳峻，楊春林，胡強(qiáng)，吳蔚，呂小艇

（樂山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川樂山614000）

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定乳及乳制品中AFM1、AFM2

李佳峻，楊春林*，胡強(qiáng)，吳蔚，呂小艇

（樂山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川樂山614000）

利用免疫親和萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）建立了乳及乳制品中黃曲霉毒素M1和M2的提取、分離、確證與定量方法。乙腈和水提取樣品中的黃曲霉毒素，乙腈二次去蛋白后用免疫親和柱凈化，采用Waters Acquity UPLCHSST3（2.1×100mm，1.7μm）色譜柱實現(xiàn)分離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下以外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：黃曲霉毒素M1和M2在0.1μg/L～50μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r﹥0.998 5）；檢出限為0.029μg/L～0.047μg/L（S/N=3）；2種黃曲霉毒素各添加水平在鮮牛奶、奶粉和奶油中的回收率為在69.56％～88.43％之間；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.69％～8.74％。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；乳及乳制品；黃曲霉毒素；免疫親和柱凈化

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）主要是由黃曲霉Aspergillus flavus Link ex Fries.和寄生曲霉Aspergillus parasiticus Speare.產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，目前報道的黃曲霉毒素已多達(dá)17種[1]。黃曲霉毒素毒性極強(qiáng)，據(jù)報道能致癌、致畸、致誘變[2-4]，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，污染范圍廣[5]，一直是農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全中的重大問題之一。對農(nóng)產(chǎn)品污染較大的主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2等，其中黃曲霉毒素B1、B2隨著飼料被動物攝入后，在肝微粒體單氧化酶系的催化作用下羥化形成同樣具有致癌毒性的黃曲霉毒素M1（AFM1）和黃曲霉毒素M2（AFM2）[6]。牛奶及其制品經(jīng)常因為奶牛食用了含有黃曲霉毒素的飼料而污染AFM1和AFM2，世界上許多國家都規(guī)定了牛奶及其制品中AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前食品中黃曲霉毒素檢測的主要方法有薄層色譜法（TLC）[7]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[8]、酶聯(lián)免疫吸附柱-熒光分光光度法（IAC-FLM）[9]、高效液相色譜法-熒光測定法（HPLC-FLD）[10-11]等。這些方法雖然在一定程度上解決了黃曲霉毒素的檢測方法問題，但由于無法對樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析，且容易出現(xiàn)假陽性等問題，不能作為最終的確證方法。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）集高效分離、多組分定性與定量于一體，已成為近年來真菌毒素檢測的主要方向[12]。近年來，關(guān)于液質(zhì)聯(lián)用法檢測食品中黃曲霉毒素的文獻(xiàn)較少[13-14]，國內(nèi)還未見HPLC-MS/MS法同時檢測乳及乳制品中黃曲霉毒素M1、M2的報道。本文以乙腈沉淀樣品中的蛋白，免疫親和柱（IAC））凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定乳及乳制品中黃曲霉毒素M1、M2，取得滿意效果。

1 材料與方法

1.1實驗儀器、試劑與樣品

1.1.1 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀UPLC I_Class（配置二元高壓泵、自動進(jìn)樣系統(tǒng)）、三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀Xevo TQD：美國waters公司；MiliQ超純水機(jī)系統(tǒng)：美國Milipore公司；冷凍離心機(jī)CR 22G：日本日立公司；氮吹儀NEVAP：美國Organomation公司；電子天平DV215CD（精確至0.000 01 g）：美國Ohaus公司；超聲波清洗器：上海冠特超聲儀器有限公司；RV10控制型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；ToxinFast黃曲霉毒素免疫親和柱：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與樣品

甲醇、乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；色譜純甲酸（色譜純）、乙酸銨（優(yōu)級純）：德國DNW公司；黃曲霉毒素M1、M2標(biāo)準(zhǔn)品：以色列Fermentek公司；Whatman玻璃纖維濾紙：英國GE Healthcare公司；所有供試樣品均在當(dāng)?shù)卮笾行统匈徺I。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子化源（ESI）；掃描模式：正離子掃描；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：450℃；脫溶劑氣體（N2）流量900 L/h；錐孔氣體（N2）流量：50 L/h；毛細(xì)管電壓：0.5 kv；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM。黃曲霉毒素M1、M2的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 黃曲霉毒素M1、M2的質(zhì)譜分析參數(shù)Table1 MS/MS parameters for detection of AFM1 and AFM2

1.3 樣品的提取與凈化

1.3.1 樣品提取

液態(tài)奶類樣品：準(zhǔn)確稱取5g樣品（精確至0.0001g），加入乙腈-水溶液（85∶15，體積比）至50mL，充分渦旋混合2min，45℃水浴20min（每隔5分鐘渦旋混合1min），8 000 r/min的轉(zhuǎn)速于4℃離心15min，上清液中再加入50mL乙腈，充分渦旋混合1min，10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，上清液轉(zhuǎn)移到100mL圓底燒瓶中于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5mL，加水稀釋至20mL，供凈化處理。

奶粉：準(zhǔn)確稱5 g均勻樣品（精確至0.000 1 g），加入乙腈-水溶液（85∶15，體積比）至50mL，于渦旋混合器上充分混合2min，45℃超聲提取20min（每隔5分鐘用手振搖10次），8000 r/min的轉(zhuǎn)速于4℃離心15min，上清液中再加入50 mL乙腈，充分渦旋混合1 min，10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，上清液轉(zhuǎn)移到100mL圓底燒瓶中于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5mL，加水稀釋至20mL，供凈化處理。

奶油等高脂肪樣品：準(zhǔn)確稱5 g樣品（精確至0.0001g），加入30mL石油醚充分溶解樣品，加入20mL水和30mL乙腈，振蕩30min后，將全部液體轉(zhuǎn)移至100mL分液漏斗中，待分層后，將下層溶液全部轉(zhuǎn)移至100mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5mL，加水稀釋至20mL，供凈化處理。

1.3.2 試液凈化

將上述稀釋后的提取液用玻璃纖維濾紙過濾2次，全部轉(zhuǎn)移至連接于免疫親和柱上端的20mL注射器筒中，調(diào)節(jié)固相萃取裝置的真空系統(tǒng)，控制試液以每秒鐘1 d～2 d的流速通過黃曲霉毒素免疫親和柱，分別以10mL純水清洗2次，至樣品完全流干后加4mL甲醇淋洗，收集淋洗液于40℃用氮氣吹至近干，用乙腈-水（1∶9，體積比）溶液定容至1mL，過0.2μm有機(jī)濾膜待測。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用乙腈-水（1∶9，體積比）將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋并配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用按照1.3的方法得到的空白樣品提取液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋成中間液和所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

實驗分別以甲醇和乙腈作為強(qiáng)洗脫劑，比較不同體系流動相對黃曲霉毒素M1、M2在色譜柱上的保留與分離情況。黃曲霉毒素M1和M2分子結(jié)構(gòu)相近、分子極性相當(dāng)且分子量相差很小，當(dāng)乙腈體系作為流動相時，由于其洗脫能力較強(qiáng)，峰形較好，但是兩種黃曲霉毒素很難實現(xiàn)基線分離。最后選用甲醇-乙腈-水體系作為流動相，以1.2.1所示的洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫，兩種目標(biāo)物質(zhì)的色譜圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素M1、M2標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution of AFM1 and AFM2

實驗采用超高效液相色譜系統(tǒng)，所用的UPLC色譜柱粒徑小，柱效高，分離速度快，黃曲霉毒素M1、M2在1.5min內(nèi)即實現(xiàn)基線分離。值得注意的是，雖然在45％有機(jī)相條件下兩種黃曲霉毒素有較好的色譜保留及分離度，但是試液中一些極性較小的雜質(zhì)可能由于沒有完全洗脫而干擾下一個樣品的分析。所以在目標(biāo)峰出現(xiàn)之后將流動相中的有機(jī)相增加到90％以使樣品中的雜質(zhì)充分洗脫，同時將流路切換至廢液而不進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，充分保護(hù)質(zhì)譜系統(tǒng)少受雜質(zhì)的污染，提高使用壽命。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過蠕動泵連續(xù)進(jìn)樣的形式，直接將標(biāo)準(zhǔn)樣品注入質(zhì)譜系統(tǒng)來優(yōu)化質(zhì)譜條件。錐孔電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)以及定性、定量離子對等可以利用質(zhì)譜軟件MassLynx4.1的Intelistart功能（智能調(diào)諧）進(jìn)行自動優(yōu)化，離子源溫度、毛細(xì)管電壓（噴霧電壓）等參數(shù)需要實驗人員手動調(diào)諧。結(jié)果表明，離子源溫度從120℃到150℃對質(zhì)譜響應(yīng)的強(qiáng)弱沒有顯著影響，而毛細(xì)管電壓的高低對質(zhì)譜響應(yīng)具有非常明顯的影響。實驗考察了毛細(xì)管電壓從3.5 kV降至0.3 kV的過程中質(zhì)譜響應(yīng)值和信噪比的變化趨勢，結(jié)果如圖2所示（以黃曲霉毒素M1為例）。

圖2 黃曲霉毒素M1在不同毛細(xì)管電壓下的信噪比Fig.2 Signal to Noise Ratio of AFM1 of different Capillary voltage

由圖2可知，毛細(xì)管電壓為3.5 kV時響應(yīng)和信噪比最低，隨著毛細(xì)管電壓的降低，響應(yīng)和信噪比越來越高，當(dāng)電壓降至0.5 kV時達(dá)到最高，當(dāng)毛細(xì)管電壓再下降時質(zhì)譜響應(yīng)也開始下降。其原因可能是流動相中加入的少量甲酸能增加樣品霧滴帶電的能力，有助于其離子化過程，所以毛細(xì)管電壓也相應(yīng)的需要降低。由于試液在離子化的過程中受溶劑的影響較大，采取不通過色譜柱而將樣品直接注入質(zhì)譜系統(tǒng)的方式進(jìn)行調(diào)諧時需要利用儀器的“T”型三通流路，結(jié)合流動相來同時進(jìn)行，否則可能發(fā)生調(diào)諧的結(jié)果與實際樣品分析的情況不符的現(xiàn)象，從而影響實驗的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。在優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)和色譜條件下，黃曲霉毒素M1、M2（濃度分別為4μg/L和5μg/L）的提取離子色譜圖見圖3。

2.3 試樣提取及凈化

圖3 黃曲霉毒素M1、M2的提取離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograms of AFM1 and AFM2 standard

由于乳和乳制品中富含的蛋白和脂肪是干擾色譜柱分離、影響峰形以及造成峰拖尾的重要因素之一。因此，找到既能最大程度除去樣品中的蛋白和脂肪又能保證樣品回收率的方法是實驗的關(guān)鍵步驟。實驗針對不同基質(zhì)的樣品建立差異性的前處理方法，為提高回收率，液態(tài)奶采用渦旋與水浴的方式提取，奶粉采用渦旋結(jié)合超聲的方式提取，奶油等高脂肪的樣品則采用石油醚除脂。用高比例的乙腈作為提取溶劑，充分利用乙腈對蛋白的沉淀作用并結(jié)合冷凍離心的方式，盡可能的除去樣品中的蛋白等雜質(zhì)。在上清液中加入等體積的乙腈并將離心的轉(zhuǎn)速提高至10 000 r/min，能進(jìn)一步將提取液中微量的蛋白質(zhì)和脂肪沉淀并析出。由于上清液中乙腈的含量很高，直接過免疫親和柱凈化會影響樣品中黃曲霉毒素與特異性抗體的結(jié)合，所以為了提高回收率，可將樣品提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至5mL左右，用水稀釋后再用免疫親和柱凈化。用建立的前處理方法和優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件對實際樣品進(jìn)行處理和分析，所得的空白樣品（A）及黃曲霉毒素M1陽性樣品（B）提取離子流色譜圖見圖4。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制、方法的線性范圍與檢出限

由于凈化后的樣品含有的少量雜質(zhì)仍然會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)影響質(zhì)譜方法的靈敏度，為了校正基質(zhì)效應(yīng)對質(zhì)譜響應(yīng)帶來的影響，本方法采用空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使得標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品的基質(zhì)背景基本一致，從而有效消除樣品基質(zhì)效應(yīng)對定量的影響。實驗表明，黃曲霉毒素M1、M2在0.10μg/L～50.00μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9985，線性方程見表2。

圖4 牛奶空白樣品及陽性樣品色譜圖Fig.4 Chromatograms of negative sample and positive sample

表2 黃曲霉毒素M1、M2標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）Table2 Standard curves,limit of detection,and limit of quantification for fAFM1 and AFM2

以3倍信噪比為檢出限（LOD），計算得出黃曲霉毒素M1、M2的檢出限分別為0.047μg/L和0.029μg/L；以10倍信噪比為定量限（LOQ），得出2種黃曲霉毒素的定量限分別為0.156μg/L和0.099μg/L。

2.5 方法的回收率和精密度

選擇陰性鮮牛奶、奶粉和奶油樣品，分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平分別為0.5、5.0、10.0μg/kg，按上述方法處理，每個濃度重復(fù)測定6次，考察方法的精密度，結(jié)果見表3。

表3 不同食品中黃曲霉毒素M1、M2的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table3 Recoveries and RSDs of AFM1 and AFM2 in different food（n=6）

在空白樣品中添加黃曲霉毒素M1、M2的平均回收率在69.56％～88.43％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于10％。

3 結(jié)論

本研究建立了免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測乳及乳制品中黃曲霉毒素M1、M2的方法。利用乙腈和水提取樣品中的黃曲霉毒素，乙腈二次去蛋白，免疫親和柱凈化能夠快速、特異的將黃曲霉毒素M1、M2從樣品中分離出來，凈化程序簡單、凈化率高，適合高蛋白樣品的凈化處理。實驗對色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用超高效液相色譜方法進(jìn)行分離，實現(xiàn)了了大量樣品的高通量檢測。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度、精密度和各項技術(shù)指標(biāo)均滿足國內(nèi)外真菌毒素檢測的要求，可用于乳及乳制品中黃曲霉毒素M1、M2的同時檢測。

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Determination of Aflatoxin M1 and M2 in Milk and Dairy Products by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LI Jia-jun，YANG Chun-lin*，HU Qiang，WU Wei，Lü Xiao-ting
（Leshan Product Quality Supervision Inspection，Leshan 614000，Sichuan，China）

A method for the determination of2 aflatoxins（M1，M2）in milk and dairy products by immunoaffinity extraction coupled with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）was developed.Aflatoxins in samples were extracted into acetonitrile/water system and deproteinized by adding additional acetonitrile，followed by stepwise purification using an immunoaffinity column.The target compounds were then eluted with methanol.With the gradient elution using a binary mobile phase containing of 0.1％formic acid solution and methanol/acetonitrile，the two aflatoxins were separated on a Waters Acquity UPLCHSST3 column（2.1×100mm，1.7μm particle size），followed by positive electrospray ionization and multi reaction monitoring provided by a triple-quadrupole tandem mass spectrometer，and quantified by external reference method.The calibration curve was linear over the concentration range of 0.1μg/L-50μg/L（r﹥0.998 5）and the detection limits of two aflatoxins were0.029μg/L-0.047μg/L.The recoveries from milk，milk powder and cream were generally between 69.56％and 88.43％and the relative standard deviations were3.69％-8.74％.

UPLC-MS/MS；fermented condiment；aflatoxins；immunoaffinity column clean-up

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.022

2012-11-03

李佳峻（1987—），女（漢），助理工程師，本科，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

*通信作者