李 程 ,閆偉平 ,常 瑩 ,吳春勝 ,谷 巖 *
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長(zhǎng)春 130118;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,長(zhǎng)春 130033;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)作物研究中心,長(zhǎng)春 130118)
在吉林省西部脆弱生態(tài)區(qū),干旱和土壤養(yǎng)分貧瘠已成為限制玉米產(chǎn)量提高的主要因素之一。水分的虧缺嚴(yán)重影響著作物對(duì)肥料,尤其是氮肥的有效吸收率。氮是植物生命中重要營(yíng)養(yǎng)元素,影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)生理生化過(guò)程[1]。氮素營(yíng)養(yǎng)狀況與土壤水分之間存在著緊密相關(guān)[2-4]。通過(guò)氮素調(diào)節(jié),可降低玉米對(duì)干旱的敏感程度,減緩因水分虧缺造成的玉米氮代謝紊亂,增強(qiáng)其抗旱性。同時(shí),水分影響氮素在土壤中的移動(dòng)和植物的吸收[5-6]。有研究表明,氮肥能夠不同程度地提高作物抗旱性[7-11],但是對(duì)產(chǎn)量的影響有一定的復(fù)雜性。在一定施氮條件下,供水后產(chǎn)量呈現(xiàn)增加趨勢(shì),高氮條件下充分供水并不利于產(chǎn)量的增加。在水分脅迫下,通過(guò)施加氮肥提高產(chǎn)量,是因?yàn)榈氐臓I(yíng)養(yǎng)作用,還是氮肥提高了抗旱性能,抑或二者的綜合作用,這些生理機(jī)制至今未明確闡明。因此,有學(xué)者從苗期開(kāi)始研究在水分和氮肥的雙重脅迫下,玉米幼苗生物量和保護(hù)酶活性等生理特性的變化,但結(jié)果不盡一致[12-13]。水分脅迫是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育的主要限制因子之一,會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的積累,導(dǎo)致膜透性增加。在水分脅迫條件下,植物需要?jiǎng)訂T整個(gè)防御系統(tǒng)抵抗水分脅迫的氧化傷害,而系統(tǒng)中各種保護(hù)酶(SOD、CAT、POD等)活性的高低就成為控制傷害的決定性因素[14]。通過(guò)不同氮肥的調(diào)節(jié),是否可以啟動(dòng)自身防御系統(tǒng)增強(qiáng)活性氧自由基的清除能力、保護(hù)植物免遭逆境傷害,氮肥對(duì)水分脅迫下玉米幼苗葉片和根系的影響有何差異?氮素代謝的主要限速酶活性變化如何?鑒于此,本文通過(guò)研究不同氮肥對(duì)水分脅迫玉米苗期保護(hù)酶活性、硝酸還原酶、葉片葉綠素和根系活力等的綜合生理特性影響,探討水分脅迫下氮素的調(diào)節(jié)機(jī)理,以期為玉米水肥效應(yīng)和相應(yīng)逆境生理提供一定的理論參考。
試驗(yàn)于2011年5月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)站進(jìn)行。供試玉米品種為先玉420。采用盆栽土培試驗(yàn)。土壤為典型黑土,基本理化性狀為pH6.88,有機(jī)質(zhì)含量為1.09%,全氮含量1.09%,全磷381.83 mg/kg,速效磷 10.68 mg/kg,速效鉀 103.84 mg/kg,堿解氮 65.27 mg/kg。
試驗(yàn)采用水分和氮肥雙因素隨機(jī)設(shè)計(jì)。水分因素設(shè)定2個(gè)水平:正常供水CK(土壤容積含水量25%)和水分脅迫W(土壤容積含水量10%);氮肥處理設(shè)定3個(gè)水平:不施加氮肥N0(不施氮肥)、N1(100 mg/kg 土)、N2(300 mg/kg土)。選取飽滿一致的玉米種子,用次氯酸鈉消毒后,在25~28℃培養(yǎng)箱中催芽,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的種子播于盆中,試驗(yàn)過(guò)程中在盆上蓋一帶孔泡沫薄板,最大限度減少水分蒸發(fā)。每處理重復(fù)6盆。2011年5月4日開(kāi)始播種,待玉米幼苗長(zhǎng)到45 d,分別取葉片和根系測(cè)定以下指標(biāo)。
取0.5 g葉片加入0.062 5 mol/L pH7.8的磷酸緩沖液 (PBS),冰浴研磨定容至5 mL,15 000 r/min,4℃下離心20 min,上清液為酶提取液。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定,以單位時(shí)間內(nèi)抑制光還原50%酶量為一個(gè)酶活性單位;過(guò)氧化物酶(POD)活性和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性分別采用愈創(chuàng)木酚法和紫外分光光度法測(cè)定[16];抗壞血酸過(guò)氧化物酶(AsP)活性參照Velikova等[16]的方法,以每分鐘氧化1μmol抗壞血酸為1個(gè)酶活單位,以樣品的鮮重計(jì)算酶活性。膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[15]。葉片葉綠素含量、根系活力和硝酸還原酶活性均參照趙世杰[15]的方法。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行處理,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,平均數(shù)用t檢驗(yàn)或Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。
圖1 不同氮肥處理和水分脅迫對(duì)玉米葉片葉綠素含量的影響
圖2 不同氮肥和水分脅迫對(duì)玉米根系活力的影響
隨著氮肥的增加,葉片葉綠素a和b都逐漸增加。但水分脅迫對(duì)葉綠素b的影響較大。在水分脅迫下,葉片葉綠素b含量比正常條件下降低36.9%(N0),35.6%(N1)和 37.5%(N2)。正常供水情況下,氮肥增加葉綠素b含量顯著增加,N1和N2水平比N0分別增加15.7%和23.2%。但在水分脅迫下,氮肥對(duì)葉綠素b的影響不大。
水分脅迫條件下,各處理玉米幼苗根系活力均顯著低于正常供水處理。正常供水下,氮肥對(duì)根系活力影響不大。但水分脅迫條件下,隨著氮肥的增加,根系活力呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。其中N1和N2處理根系活力比N0分別提高14.4%和35.5%。
超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的活性氧清除酶[17],它的主要功能是催化超氧物陰離子自由基O2-,發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2,當(dāng)外來(lái)脅迫導(dǎo)致大量活性氧產(chǎn)生時(shí),它能及時(shí)有效地清除自由基,保護(hù)細(xì)胞免受活性氧脅迫的傷害。而過(guò)氧化物酶(POD)也是廣泛存在于植物體內(nèi)的重要抗氧化酶之一[18]。從表1可以看出:適量的氮素可以緩解水分脅迫對(duì)玉米葉片和根系活性的傷害,其中對(duì)根系的效應(yīng)要強(qiáng)于葉片。
表1 不同氮肥處理和水分脅迫對(duì)玉米幼苗SOD和POD活性的影響
氮肥和水分脅迫下玉米葉片和根系SOD酶活性變化一致。正常供水和水分脅迫條件下,隨著氮肥的增加,SOD活性均顯著增加,高氮處理酶活性顯著降低。氮肥和水分脅迫對(duì)玉米葉片和根系過(guò)氧化物酶活性的影響不同。在葉片中,正常供水條件下氮肥的施入增加了POD酶活性,處理間無(wú)顯著差異。但在水分脅迫下,同一氮肥處理下葉片POD活性均低于正常供水。中等氮肥處理N1顯著提高了POD活性,隨著氮素的進(jìn)一步提高,達(dá)到N2水平時(shí),POD酶活性下降,與N1水平時(shí)存在顯著差異,與N0差異不大。根系POD活性對(duì)氮肥和水分脅迫的響應(yīng)相同,N1水平顯著增加POD活性,N2水平POD活性顯著降低。
植物組織中高濃度的H2O2主要靠過(guò)氧化氫酶(CAT)清除[18]。CAT是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成成分,是以H2O2為底物的酶,分解H2O2為O2和H2O,抗壞血酸過(guò)氧化物酶(AsP)在此過(guò)程中發(fā)揮著很重要的作用。從表2可以看出:水分脅迫下,玉米葉片和根系CAT和AsP活性隨著氮肥的增加,先升高后降低。中氮N1水平顯著提高了對(duì)H2O2的清除能力。正常供水條件下,葉片和根系對(duì)氮肥的響應(yīng)不同。氮肥對(duì)葉片的影響不大。但N1水平卻顯著提高了根系CAT和AsP的活性,N2處理酶活性則低于N0。
表2 不同氮肥處理和水分脅迫對(duì)玉米幼苗CAT和AsP活性的影響
植物器官在逆境脅迫下往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用,丙二醛是活性氧啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生傷害的主要產(chǎn)物之一,其含量可以反應(yīng)植物遭受損傷的程度[19]。從圖3、圖4可以看出,水分脅迫下,丙二醛含量顯著增加,根系丙二醛含量的增加幅度要大于葉片。正常供水條件下,氮肥對(duì)玉米幼苗葉片和根系丙二醛含量影響不大。水分虧缺下,過(guò)量氮肥使得丙二醛含量顯著增加。N2處理比N0處理增加 12.8%(葉片)和 19.7%(根系)。
圖3 不同氮肥處理和水分脅迫對(duì)玉米幼苗葉片丙二醛含量的影響
圖4 不同氮肥處理和水分脅迫對(duì)玉米幼苗根系丙二醛含量的影響
圖5 不同氮肥處理和水分脅迫對(duì)玉米葉片硝酸還原酶活性的影響
硝酸還原酶是作物氮素同化的第一個(gè)限速酶,在氮代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用[20]。從圖5,圖6可以看出,水分脅迫使得葉片和根系硝酸還原酶活性顯著降低,根系降低的幅度要高于葉片。水分脅迫下,氮肥對(duì)葉片和根系硝酸還原酶活性影響不大,增施氮肥并沒(méi)有提高硝酸還原酶的活性。在正常供水下,適量氮肥的施入顯著提高了硝酸還原酶活性,分別比不施氮肥增加30.8%(葉片)和96.7%(根系);高氮的施加則相反,氮素的過(guò)飽和阻礙了玉米根系硝酸還原酶的合成,使得根系吸收氮肥的能力減弱,進(jìn)而影響葉片的硝酸還原酶活性也隨之降低,分別比不施用氮肥降低14.6%(葉片)和 37.4%(根系)。
圖6 不同氮肥處理和水分脅迫對(duì)玉米根系硝酸還原酶活性的影響
葉綠素a與葉綠素b是高等植物葉綠體色素的重要組分,約占葉綠體色素總量的75%左右。任何逆境脅迫都可以影響葉綠素的含量與組成,進(jìn)而影響植物的光合速率。在本試驗(yàn)中,水分脅迫對(duì)葉片葉綠素a含量影響不大,葉綠素b的含量顯著降低。有研究結(jié)果表明[12],氮肥可提高水分脅迫下葉綠素的合成能力及葉片光合酶系統(tǒng)的活性。而高水平的氮素使光合速率和生長(zhǎng)量均降低。在本試驗(yàn)設(shè)定的兩種土壤水分條件下,隨著氮肥的增加,葉綠素a和b含量均有不同程度的增加。玉米根系是活躍的吸收和合成器官,根的生長(zhǎng)情況直接影響到地上部葉片的營(yíng)養(yǎng)狀況,所以根系活力對(duì)于了解逆境下玉米對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收等有重要作用。水分脅迫顯著降低了根系活力。但不同土壤水分下,根系活力對(duì)氮肥的響應(yīng)存在較大差異。正常供水下,氮肥對(duì)根系活力影響不大,處理間無(wú)顯著差異。而在水分虧缺下,隨著氮肥的增加玉米幼苗根系活力逐漸增強(qiáng)。
在綠色植物中,由逆境導(dǎo)致的氧化脅迫是一種普遍現(xiàn)象。在逆境脅迫下,細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除的平衡遭到破壞,自由基產(chǎn)生或積累過(guò)多,啟動(dòng)膜脂脫氧化反應(yīng),細(xì)胞代謝紊亂,致使植物受到傷害。O2·-是活性氧的主要成員,它既可以直接啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化,又可以與H2O2生成更多的活性氧,加劇膜系統(tǒng)的破壞。SOD是清除O2-的重要酶,在活性氧清除系統(tǒng)中發(fā)揮著特別重要的作用,能催化生物體內(nèi)分子氧活化的第一個(gè)中間物發(fā)生歧化反應(yīng),從而減輕O2·-對(duì)植物體的毒害作用。CAT、POD和AsP被認(rèn)為是葉綠體中清除 H2O2的酶,只有清除細(xì)胞內(nèi) H2O2的 CAT、POD、AsP和清除O2·-的SOD的協(xié)同作用,才能保證細(xì)胞的正常機(jī)能[22]。有研究表明,氮素在水分虧缺條件下對(duì)植物抗旱性能的影響具有雙重性。適度的氮素營(yíng)養(yǎng)明顯提高了水分脅迫玉米幼苗葉片SOD、POD、CAT的活性,更好地保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,增強(qiáng)超氧化物自由基的清除能力,有效抑制了膜脂過(guò)氧化水平,提高玉米幼苗抗旱能力。但過(guò)量的氮肥則相反,會(huì)降低其抗旱能力[13]。在本研究中,正常供水條件下,適量的氮肥對(duì)SOD、POD的影響效應(yīng)要強(qiáng)于CAT、AsP,在高氮處理下,葉片POD活性仍然高于N0處理,而SOD、CAT、AsP活性則顯著降低。氮肥對(duì)水分脅迫下玉米幼苗根系四種保護(hù)酶活性影響較大,遵循“低促高抑”的原則。
硝酸還原酶是植物氮素代謝的限速酶,催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。本試驗(yàn)中,正常供水下適度的氮肥顯著提高了葉片和根系硝酸還原酶活性,以根系的響應(yīng)最為明顯。過(guò)量的氮素則抑制了酶活性。而在水分脅迫下,氮肥的加入對(duì)葉片和根系硝酸還原酶活性的影響不大,3個(gè)處理間無(wú)顯著差異。說(shuō)明在水分虧缺條件下,土壤水分對(duì)硝酸還原酶的影響比氮肥的作用大。在劉建新等人的研究中,在嚴(yán)重缺水條件下,硝酸還原酶活性在施氮后低于不施肥處理[12]。
此外,在本研究中,葉片葉綠素a、葉綠素b含量、根系活力、葉片和根系硝酸還原酶、保護(hù)酶活性之間并不完全存在顯著相關(guān)性,玉米自身對(duì)逆境脅迫也存在一定的彈性,在一定程度上可啟動(dòng)自身的防御系統(tǒng)來(lái)減輕自身細(xì)胞代謝的紊亂,且不同抗性品種間反應(yīng)不同。氮肥的適量施入對(duì)水分脅迫玉米細(xì)胞代謝等存在一定的積極作用。但在西部干旱區(qū)水分虧缺條件下,也一定要嚴(yán)格控制氮肥的施用量,過(guò)少或過(guò)多的施用氮肥都會(huì)對(duì)玉米生理機(jī)制產(chǎn)生影響,進(jìn)而影響產(chǎn)量。
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