趙紫微,潘道東,曾小群,王淑慧
(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波315211)
乳清蛋白主要存在于工業(yè)生產(chǎn)干酪的副產(chǎn)品-乳清中,它是一種高營(yíng)養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)蛋白[1]。但是根據(jù)一些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),每年大約有40%~50%的乳清被浪費(fèi);在這些乳清被浪費(fèi)同時(shí),大量的乳清蛋白也被浪費(fèi);因此對(duì)乳清蛋白的綜合利用也備受關(guān)注[2]。乳清蛋白不但含有許多生物活性物質(zhì),而且具備很高的代謝率,容易被消化;因而具有很高的生物利用價(jià)值和功能特性。
乳清蛋白溶液具備良好功能特性,比如膠凝性、溶解性等,所以它可以作為一種食品組分來(lái)賦予食品一些特殊的感官性質(zhì)[3-5]。特別是近年來(lái)隨著消費(fèi)者對(duì)低脂食品需求的升高,對(duì)脂肪替代品的開發(fā)和研究已經(jīng)逐漸地引起了相關(guān)工作人員的重視,部分學(xué)者開始利用酶改性乳清蛋白來(lái)研究和開發(fā)脂肪替代品[6-8]。這其中采用最多的是利用地衣芽孢桿菌蛋白酶(BLP)和堿性蛋白酶(Alcalase2.4L)來(lái)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)凝膠,但是目前關(guān)于酶誘導(dǎo)蛋白質(zhì)凝膠的影響因素方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。
本實(shí)驗(yàn)選用中性蛋白酶對(duì)乳清蛋白進(jìn)行水解,在適當(dāng)條件下制備質(zhì)構(gòu)特性類似脂肪的凝膠。先在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上研究了不同的參數(shù)如pH、溫度、酶與底物比、黃原膠對(duì)凝膠性質(zhì)影響,然后進(jìn)行了Box-Behnken實(shí)驗(yàn)并利用模糊數(shù)學(xué)結(jié)合響應(yīng)曲面法優(yōu)化了誘導(dǎo)條件。對(duì)酶誘導(dǎo)蛋白質(zhì)成膠的一些相關(guān)因素進(jìn)行了研究和探討,為低脂食品的研究和開發(fā)提供了借鑒。
乳清蛋白粉 寧波大學(xué)曹光彪科技樓127實(shí)驗(yàn)室提供;中性蛋白酶 酶活力為100000U/g,寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;氯化鈣、黃原膠 國(guó)藥生物科技有限公司;參考奶油 市售;其余化學(xué)分析試劑 均為分析純。
PL403電子天平、FE-20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DK-20電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)分析儀StableMicro System公司;NICOMP 380/ZLS納米粒度分析儀 美國(guó)PSS公司。
1.2.1 凝膠制備工藝參數(shù)的單因素實(shí)驗(yàn) 為了探究各個(gè)工藝參數(shù)對(duì)所制備凝膠的性質(zhì)影響,并為響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的各因素與水平的選擇提供依據(jù)[9]。分別選取體系pH、凝膠溫度、黃原膠添加量、酶與底物濃度比等4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。具體為:體系pH:考察體系pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0時(shí)的凝膠效果;凝膠溫度:考察凝膠溫度分別為35、40、45、50、55℃時(shí)的凝膠效果;黃原膠添加量:考察黃原膠添加量為0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%時(shí)凝膠效果;酶與底物濃度比:分別觀察酶與底物濃度比為0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%時(shí)的凝膠效果;在考察單因素時(shí),其他各因素的水平分別設(shè)定為:乳清蛋白質(zhì)量濃度1g/10mL、氯化鈣添加量2mmol/L、反應(yīng)pH7.0、反應(yīng)溫度45℃、黃原膠添加量0.01%、酶與底物濃度比0.75%。
1.2.2 凝膠的質(zhì)構(gòu)分析 參照Charles[10]的方法略有改動(dòng),采用TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)分析儀對(duì)樣品的質(zhì)構(gòu)進(jìn)行分析。具體如下,先將凝膠樣品裝入直徑為45mm、高55mm的燒杯中,樣品高度為30mm,然后用25mm直徑的平底探頭對(duì)膠體進(jìn)行擠壓測(cè)定。探頭的測(cè)試速度為1mm/s,下降距離為10mm。利用儀器自帶的軟件分析得到凝膠的相關(guān)質(zhì)構(gòu)參數(shù):黏附性(取絕對(duì)值)、硬度、彈性。實(shí)驗(yàn)測(cè)定每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次,取平均值。
1.2.3 凝膠持水度的測(cè)定 凝膠的持水性計(jì)算公式如下所示[11]。準(zhǔn)確稱取適量凝膠樣品置于10mL離心管中離心30min,轉(zhuǎn)速為4000r/min。
持水性(%)=(吸去水分后離心管質(zhì)量(g)-離心管質(zhì)量(g))/凝膠樣品質(zhì)量(g)×100
表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in response surface analysis
1.2.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,采用Design-Expert 8.00軟件,選取體系pH、凝膠溫度、酶與底物濃度比這3個(gè)因素在3個(gè)水平上進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn),其中響應(yīng)值為凝膠的綜合素質(zhì)得分。共計(jì)17組實(shí)驗(yàn),其中5個(gè)為中心點(diǎn)。
1.2.5 凝膠的綜合素質(zhì)評(píng)定 根據(jù)凝膠樣品質(zhì)量的指標(biāo)內(nèi)容,以及黏附性、硬度、彈性、持水度這四個(gè)因素對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的重要程度的不同。先設(shè)定凝膠樣品質(zhì)量指標(biāo)集U和權(quán)重向量A,然后計(jì)算凝膠的綜合素質(zhì)。凝膠質(zhì)量指標(biāo)集,其中u1、u2、u3、u4分別表示黏附性、硬度、彈性、持水度。
各因素的權(quán)重向量A=(a1,a2,a3,a4)=(0.3,0.3,0.3,0.1),并且a1+a2+a3+a4=1。
1.2.6 凝膠成品的粒徑分析 粒徑分布按Pan[12]所述方法進(jìn)行測(cè)定,稱取適量的凝膠配成2%溶液后攪拌1h,轉(zhuǎn)速為200r/min,然后用粒徑分布儀進(jìn)行測(cè)定。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 16.0軟件分析各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)凝膠性質(zhì)的影響,采用LSD值對(duì)一維線性方差進(jìn)行顯著性分析,且當(dāng)p<0.05時(shí)為顯著。
圖1 pH對(duì)凝膠時(shí)間和持水性,凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響Fig.1 Effect of pH on gelling time,water holding capacity,and textural properties of the gel
2.1.1 pH對(duì)凝膠效果的影響 由圖1可知,隨著pH逐漸升高,凝膠時(shí)間逐漸變長(zhǎng);持水性先上升后下降,在pH為7.5時(shí)達(dá)到最高(p<0.05),為84.7%;同時(shí),凝膠的黏附性、硬度和彈性都呈下降趨勢(shì)。這可能因?yàn)閜H在6~8這個(gè)區(qū)間內(nèi),隨著體系的pH不斷變大,中性蛋白酶的活性逐漸變低,導(dǎo)致其對(duì)乳清蛋白酶解作用的功效降低;凝膠速度會(huì)變慢,其結(jié)構(gòu)也會(huì)隨之變得更有規(guī)則,不會(huì)呈雜亂無(wú)章的聚集狀態(tài),故而持水性變高、黏附性、硬度和彈性均降低[12]。但是,過(guò)高pH是會(huì)影響凝膠的色澤、降低其風(fēng)味;況且太長(zhǎng)凝膠時(shí)間也是不合適的。
2.1.2 凝膠溫度對(duì)凝膠效果的影響 由圖2可知,隨著溫度的升高,凝膠的硬度一直上升;而凝膠時(shí)間和凝膠的彈性都呈下降趨勢(shì);凝膠的持水性和黏附性表現(xiàn)為先上升后下降,當(dāng)溫度為45℃時(shí)兩者均達(dá)到最大值(p<0.05),分別為85.6%和0.65。這表明隨著溫度的升高,中性蛋白酶的活性增強(qiáng),對(duì)乳清蛋白的降解過(guò)程加快,進(jìn)而凝膠時(shí)間變短。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn),在45℃時(shí)形成的凝膠質(zhì)地不但結(jié)構(gòu)均勻細(xì)膩,顏色上也是充滿光澤。在45~55℃這個(gè)溫度區(qū)間內(nèi),由于溫度的持續(xù)上升可能導(dǎo)致了體系形成熱誘導(dǎo)凝膠,從而促使凝膠的硬度增大、彈性減小、黏附性開始下降。
圖2 凝膠溫度對(duì)凝膠時(shí)間和持水性,凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響Fig.2 Effect of temperature on gelling time,water holding capacity,and textural properties of the gel
2.1.3 黃原膠添加量對(duì)凝膠效果的影響 由圖3可知,隨著黃原膠添加量的增多,凝膠速度加快、凝膠時(shí)間變短;凝膠的持水性、硬度、粘附性、彈性都近似呈線性上升趨勢(shì)。這表明在0~0.02%范圍內(nèi),隨著黃原膠量的增多,凝膠的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)和持水性均向有利態(tài)勢(shì)發(fā)展。這可能與黃原膠的性質(zhì)有關(guān),黃原膠是一種水溶性高分子多糖。一方面,由于其分子量大,溶于水后會(huì)充分水化而束縛了大量的自由水;另一方面,它的大體積分子也會(huì)和介質(zhì)發(fā)生相互作用,阻礙介質(zhì)的自由移動(dòng)。所以,體系的層流間就會(huì)產(chǎn)生阻力阻礙其流動(dòng)性,因而體系的黏附性會(huì)升高[13]。但是黃原膠的添加量也不宜太多,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)添加過(guò)多黃原膠后,凝膠的組織粗糙、質(zhì)地堅(jiān)硬,這對(duì)凝膠也是不利的。因此,黃原膠的量定為0.015%。
圖3 黃原膠添加量對(duì)凝膠時(shí)間和持水性,凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響Fig.3 Effect of xanthan gum on gelling time,water holding capacity,and textural properties of the gel
圖4 酶與底物濃度比對(duì)凝膠時(shí)間和持水性,凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響Fig.4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on gelling time,water holding capacity,and textural properties of the gel
2.1.4 不同酶與底物濃度比對(duì)凝膠效果的影響 如圖4所示,隨著酶與底物濃度比的上升,凝膠時(shí)間、黏附性、硬度呈逐漸下降趨勢(shì);凝膠彈性先下降后又上升,在酶與底物濃度比為1%時(shí)彈性最低(p<0.05),為0.93;持水性呈波浪形變化趨勢(shì),先升高后降低、然后又升高再降低。這表明隨著酶的含量上升,酶解反應(yīng)速率加快,凝膠時(shí)間變短;一般來(lái)說(shuō),不斷加快的凝膠速度會(huì)導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)變得不規(guī)則,呈現(xiàn)出雜亂無(wú)章的聚集狀態(tài),凝膠的黏附性、硬度和彈性也會(huì)隨之上升[12]。但是在實(shí)驗(yàn)中凝膠的黏附性、硬度均呈下降趨勢(shì),持水性也呈特殊的變化趨勢(shì)、分別在0.5%和1.0%這兩個(gè)點(diǎn)達(dá)到較高值(p<0.05)。這些特殊的凝膠性質(zhì)可能是由于在成膠點(diǎn)時(shí)的水解程度、聚集顆粒的特性不同[14]。
根據(jù)凝膠質(zhì)量各個(gè)指標(biāo)所占的權(quán)重不同,采用公式Y(jié)=A×U計(jì)算Box-Behnken實(shí)驗(yàn)中17個(gè)實(shí)驗(yàn)組的凝膠綜合素質(zhì)。其中,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)如下。
相應(yīng)的Y1=(0.3,0.3,0.3,0.1)×,同理可得Y2,Y3,Y4,Y5·……Y17。
Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二元多次回歸分析,得到擬合方程為Y=0.1652A+ 0.02547B+0.5658C-0.0002AB-0.048AC-0.0098A2-0.000258B2-0.1592C2(其中BC項(xiàng)的系數(shù)為3.816×10-18,因此可以忽略不計(jì)),此時(shí)模型的p值為0.0239,小于0.05,即模型顯著;模型的Lack of Fit的p值為0.7318,大于0.05。這說(shuō)明擬合方程的擬合效果良好,能夠滿足響應(yīng)面分析的要求。
表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experimental results
根據(jù)表3,模型中只有A為極顯著、C2為顯著;其余項(xiàng)均不顯著;三個(gè)因素對(duì)凝膠效果的影響依次為A>B>C,相應(yīng)的pH>凝膠溫度>酶與底物濃度比。
依據(jù)上面的分析,三個(gè)交互項(xiàng)均不顯著,說(shuō)明三者之間都沒(méi)有相互的影響。圖5列出了響應(yīng)面的三維圖。通過(guò)Design-Expert 8.00軟件分析得到凝膠綜合素質(zhì)最高可達(dá)到0.721,此時(shí)的各因素的工藝條件為:pH6.5、凝膠溫度46.8℃、酶與底物濃度比0.8%。
表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for response surface reduced quadratic model
采用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),為了方便,參數(shù)定為pH6.5、凝膠溫度47℃、酶與底物濃度比0.8%。最后所得Y值為0.720,與理論值0.721非常接近,可見所確定的模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖5 各相互因素對(duì)凝膠綜合得分影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Effect of two factors on Y value by response surface analysis
通過(guò)對(duì)參數(shù)分別為pH6.5、凝膠溫度47℃、酶與底物濃度比0.8%、黃原膠0.015%的凝膠的質(zhì)構(gòu)、持水性和粒徑分析可以得到,凝膠的黏附性、硬度、彈性分別為0.72N·S、0.35N、0.94,與參考奶油比較接近(見表4,其中參考奶油的質(zhì)構(gòu)值按1.2.2中所述方法測(cè)定);持水度為83.3%,凝膠的平均粒徑為22.63μm。由于凝膠顆粒細(xì)小均勻,因此可以用來(lái)模擬脂肪。
表4 凝膠和參考奶油的質(zhì)構(gòu)值Table 4 Textural properties of gel and reference cream
通過(guò)對(duì)凝膠條件單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn),結(jié)合響應(yīng)曲面分析,建立起了凝膠參數(shù)的二次多項(xiàng)式模型。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)響應(yīng)曲面確定的該模型是合理的,能夠較好地預(yù)測(cè)凝膠的綜合性質(zhì)。通過(guò)模型分析和實(shí)驗(yàn)修正后得到的最佳參數(shù):pH6.5、凝膠溫度47℃、酶與底物濃度比0.8%、氯化鈣2mmol/L、黃原膠0.015%。該條件下所制備的凝膠的綜合素質(zhì)為0.720,色澤乳黃、質(zhì)構(gòu)指標(biāo)和脂肪比較接近。
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