響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)刺頭多糖除蛋白工藝的研究

楊 斌，楊 英，王雪飛，胡彥卿，范琳琳，劉丹丹，朱 浩

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

藍(lán)刺頭（Echinops latifolius Tausch）為菊科藍(lán)刺頭屬植物。其根和頭狀花序入藥，味苦、性寒、歸胃經(jīng)，具有清熱解毒、排膿止血、消癰下乳、接骨療傷的功效，用于治療諸瘡癰腫、乳汁不通、骨折等癥[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)刺頭具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、殺蟲、保肝等功效[2-5]，藍(lán)刺頭多糖是其主要活性成分之一。近年來，多糖所具有的各種生理功能逐漸被人們所重視，如降低血糖濃度、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等。從天然動植物提取的多糖，往往含有大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的存在不僅可能影響其結(jié)構(gòu)和生物活性，且可能導(dǎo)致藥理作用下降，因此，脫蛋白是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。常見的脫蛋白方法有三氯乙酸法、Sevage法、木瓜蛋白酶法等[6]，不同的除蛋白方法適用于不同來源的多糖，目前尚未見到去除藍(lán)刺頭多糖中蛋白質(zhì)方法的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對以上3種方法的比較，對藍(lán)刺頭多糖中蛋白質(zhì)最佳去除方法進(jìn)行了探討，以清潔、條件溫和、操作簡單的方法為多糖類藥品和保健產(chǎn)品的開發(fā)提供了有利條件。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

藍(lán)刺頭 采摘自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市，植物鑒定由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)教研室完成；木瓜蛋白酶，牛血清白蛋白 Sigma；考馬斯藍(lán)G-250（Amresco），葡萄糖、三氯乙酸、三氯甲烷、苯酚、正丁醇、濃硫酸等 均為分析純。

Synergy H4型全功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；KQ-500VDB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取工藝流程 藍(lán)刺頭用蒸餾水洗凈，置于70℃烘箱烘干，粉碎，過40目篩，加30倍蒸餾水超聲提取20min，超聲功率為360W，溫度為30℃，藥液過濾，3000r/min離心10min，取上清液，得多糖溶液。

1.2.2 多糖含量的測定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定[7]。多糖保留率（%）=脫蛋白后多糖的含量/脫蛋白前多糖的含量×100。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行[8]測定。蛋白去除率（%）=（脫蛋白前蛋白的含量-脫蛋白后蛋白的含量）/脫蛋白前蛋白的含量×100。

1.3 脫蛋白方法

1.3.1 TCA法[9]首先于每只具塞試管中加入5mL多糖提取液，再分別加入1、2、3、4、5mL 3mol·L-1的三氯乙酸溶液，混勻后4℃靜置過夜，離心棄去沉淀，測定上清液中蛋白和多糖的濃度。

1.3.2 Sevage法[10]取50mL多糖提取液，按照多糖提取液、氯仿、正丁醇的體積比為16∶4∶1加入氯仿與正丁醇，溶液劇烈振蕩30min后靜置，待液體分層后分離出上清液，重復(fù)多次上述步驟，每次測定上清液中蛋白和多糖濃度。

1.3.2.1 木瓜蛋白酶法[11]取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），溫度為60℃，酶解2.5h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10min，冷卻至室溫，3000r/min離心10min除去沉淀，測定上清液中蛋白和多糖濃度。

1.3.3 木瓜蛋白酶法除蛋白單因素實(shí)驗(yàn)[11]

1.3.3.1 酶解溫度對蛋白去除率的影響 分別取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），調(diào)節(jié)pH為5.0，酶解時(shí)間為1.5h，酶解溫度分別為50、55、60、65、70℃，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10min，冷卻至室溫，3000r/min離心10min除去沉淀，測定上清液中蛋白濃度。

1.3.3.2 酶解時(shí)間對蛋白去除率的影響 分別取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），調(diào)節(jié)pH為5.0，酶解溫度為60℃，酶解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10min，冷卻至室溫，3000r/min離心10min除去沉淀，測定上清液中蛋白濃度。

1.3.3.3 酶解pH對蛋白去除率的影響 分別取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液，調(diào)節(jié)pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，60℃水浴酶解2h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10min，冷卻至室溫，3000r/min離心10min除去沉淀，測定上清液中蛋白濃度。

1.3.4 酶解的響應(yīng)面優(yōu)化方案 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇A（溫度）、B（時(shí)間）、C（pH）為影響因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析方案（見表1），進(jìn)行除蛋白工藝參數(shù)的優(yōu)化。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 TCA法除蛋白結(jié)果

TCA是酸性物質(zhì)，能使蛋白質(zhì)帶正電荷，并與負(fù)離子結(jié)合成不溶性的鹽類。TCA法除蛋白結(jié)果見圖1。由圖1可知，蛋白清除率隨著TCA加入量的增加，從45.13%增加到48.76%，同時(shí)多糖結(jié)構(gòu)的破壞程度也相應(yīng)的增加，導(dǎo)致多糖的損失逐漸增大，多糖保留率從61.05%減少到37.38%。

圖1 TCA法脫蛋白效果Fig.1 The effect of removal with the TCA

2.2 Sevage法除蛋白結(jié)果

Sevage法是利用有機(jī)溶劑能夠使溶液中的蛋白質(zhì)變性沉淀的性質(zhì)分離清除蛋白質(zhì)。Sevage法除蛋白結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加蛋白清除率也相應(yīng)的升高，Sevage法脫蛋白3次時(shí)蛋白清除率為47.47%，此后隨著脫除次數(shù)的增加，蛋白清除率基本保持穩(wěn)定，而多糖隨脫除次數(shù)的增加損失逐步加大，多糖保留率從75.41%減少到58.57%。

圖2 Sevage法脫蛋白效果Fig.2 The effect of removal with the Sevage

2.3 三種脫蛋白方法比較

將三種脫蛋白方法進(jìn)行綜合比較，由表2可知，酶法蛋白清除率（56.57%）高于TCA法（45.13%）與Sevage法（47.47%），其多糖保留率（98.16%）亦遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種方法（TCA法61.05%，Sevage法67.65%），同時(shí)三氯乙酸酸性較強(qiáng)，可能引起多糖降解，Sevage法過程操作繁瑣，酶法的反應(yīng)條件溫和，操作簡便，綜合分析三種除蛋白方法，確定使用酶法對藍(lán)刺頭多糖中蛋白質(zhì)進(jìn)行脫除，并使用響應(yīng)面法對其除蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表2 三種脫蛋白方法效果比較（±s，n=3）Table 2 The comparison of deproteinization effect of three methods（±s，n=3）

表2 三種脫蛋白方法效果比較（±s，n=3）Table 2 The comparison of deproteinization effect of three methods（±s，n=3）

指標(biāo) TCA法 Sevage法 木瓜蛋白酶法蛋白脫除次數(shù) 1 3 1蛋白清除率（%） 45.13±0.09 47.47±0.13 56.57±0.12多糖保留率（%） 61.05±0.11 67.65±0.13 98.16±0.06

2.4 酶法除蛋白單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 pH對蛋白去除率的影響 隨著多糖溶液的pH不同，酶對蛋白的清除率也相應(yīng)的產(chǎn)生變化，由圖3可知，pH為5時(shí)蛋白的清除率最大，說明該酶的最適反應(yīng)pH為5.0左右，所以選擇pH4、5、6作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心值。

圖3 pH對蛋白清除率的影響Fig.3 Effect of pH on protein removal efficiency

圖4 酶解時(shí)間對蛋白清除率的影響Fig.4 Effect of time on protein removal efficiency

2.4.2 酶解時(shí)間對蛋白去除率的影響 由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的延長蛋白清除率也在逐步增大，但1.5h之后蛋白清除率沒有隨著酶解時(shí)間的延長而增大，說明反應(yīng)的最適時(shí)間為1.5h左右，所以選擇時(shí)間1、1.5、2h作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心值。

2.4.3 酶解溫度對蛋白去除率的影響 由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白的清除率先升高后下降，溫度超過65℃后，蛋白的清除率開始明顯的下降，說明該酶的最適反應(yīng)溫度在65℃左右，所以選擇溫度60、65、70℃作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心值。

2.4.4 響應(yīng)面結(jié)果與分析 響應(yīng)面優(yōu)化方案與結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design expert V8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸分析，得出實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值影響的回歸方程為：

表3 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果Table 3 Program and experimental results of response surface methodology

對回歸模型進(jìn)行方差分析可知（表4），該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)（p=0.0897＞0.05）不顯著，并且該模型決定系數(shù)R2=98.53%，表明自變量與響應(yīng)值之間的模型關(guān)系顯著，該模型能夠解釋98.53%響應(yīng)值的變化，說明回歸方程與實(shí)際情況擬合良好，可以用此模型來分析和預(yù)測酶法去除藍(lán)刺頭多糖中蛋白的結(jié)果。F值可以反映出各因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的重要性，由F值得到因素貢獻(xiàn)率為：C＞B＞A，即pH＞時(shí)間＞溫度，其中pH和時(shí)間對方程影響極顯著，溫度的影響為顯著。對模型各項(xiàng)進(jìn)行方差分析可知，模型中一次項(xiàng)A（溫度）對蛋白清除率的影響為顯著（p＜0.05），一次項(xiàng)B（時(shí)間）、C（pH），交互項(xiàng)AB、AC、BC、A2、B2、C2各項(xiàng)對蛋白清除率的影響均為極顯著（p＜0.01）。

表4 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of mathematical regression model

圖6 溫度與時(shí)間對蛋白脫除率的影響Fig.6 Effect of temperature and time on protein removal efficiency

三個(gè)因素交互作用對蛋白清除率影響的響應(yīng)曲面的分析結(jié)果見圖6～圖8。其中等高線的形狀可直觀的反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著。圖6表示pH為0水平，即pH為5時(shí)，反應(yīng)時(shí)間和溫度對蛋白清除率的影響。由圖6可知，當(dāng)固定溫度不變時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，蛋白清除率逐步增加，反應(yīng)2h左右蛋白清除率達(dá)到比較平穩(wěn)的階段，變化不再明顯。當(dāng)固定時(shí)間不變的情況下，蛋白清除率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。兩者之間的影響可以通過等高線看出。等高線呈橢圓，說明兩者相互作用對蛋白脫除率的影響顯著，且時(shí)間在2h、溫度在65℃左右蛋白清除率有最大值。

圖7表示當(dāng)固定酶解時(shí)間在0水平，即時(shí)間為1.5h，反應(yīng)體系的pH和溫度對蛋白清除率的影響。由圖7可以看出，當(dāng)固定pH不變的情況下，隨著溫度的升高蛋白清楚率逐漸增大，65℃左右達(dá)到最大值后趨向平穩(wěn)。當(dāng)固定溫度不變時(shí)，隨著pH的增加，蛋白清除率先增大后減小，在5.5左右達(dá)到最大值。由等高線可以看出pH和溫度交互作用對蛋白清除率的影響顯著，蛋白清除率的最大值出現(xiàn)在pH5.5溫度65℃左右。

圖7 溫度與pH對蛋白脫除率的影響Fig.7 Effect of temperature and pH on protein removal efficiency

圖8表示當(dāng)固定反應(yīng)的溫度在0水平，即溫度65℃，反應(yīng)的pH和時(shí)間對蛋白清除率的影響。由圖8可知，當(dāng)固定反應(yīng)的pH不變的情況下，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，蛋白清除率逐漸增大，2h左右達(dá)到最大值，之后曲面趨向平緩。當(dāng)固定反應(yīng)時(shí)間不變時(shí)，隨著pH的增大，在5.5左右蛋白清除率達(dá)到最大值，之后趨向平緩。由等高線可知，pH和時(shí)間兩因素的交互作用對蛋白清除率的影響顯著，蛋白清除率的最大值出現(xiàn)在pH5.5、時(shí)間2h左右。

圖8 時(shí)間與pH對蛋白清除率的影響Fig.8 Effect of time and pH on protein removal efficiency

通過數(shù)據(jù)分析得到藍(lán)刺頭多糖除蛋白的最佳工藝參數(shù)為溫度63.69℃，時(shí)間2.64h，pH5.84，得出最大蛋白清除率為56.82%，多糖保留率為98.12%，效果良好。

2.5 最佳工藝驗(yàn)證

實(shí)際應(yīng)用中對酶法除蛋白的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，之后對同一批多糖提取液進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3），蛋白去除率為56.57%±0.03%，接近于理論去除率56.82%，說明該提取工藝是可操作性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of process verification

3 結(jié)論與討論

Sevage法除蛋白過程復(fù)雜，需要多次重復(fù)，雖然三氯乙酸法操作相對簡單，但這兩種方法的的多糖損失率均較高，同時(shí)在反應(yīng)過程中使用了大量的有機(jī)試劑，勢必會造成有機(jī)物的殘留。木瓜蛋白酶法與TCA法和Sevage法比較其反應(yīng)條件溫和，且不引入有機(jī)試劑，蛋白清除率和多糖保留率均較高，因而能夠較好應(yīng)用于后續(xù)科研及實(shí)際生產(chǎn)中。本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH為因素，蛋白清除率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法對木瓜蛋白酶去除藍(lán)刺頭多糖中蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用情況得到最佳反應(yīng)條件為溫度：64℃，時(shí)間2.6h，pH為6.0，此條件下的蛋白清除率為56.57%，多糖的保留率為98.16%。綜合比較三種方法，木瓜蛋白酶法更適用于藍(lán)刺頭多糖中蛋白質(zhì)的去除，此法條件溫和、操作簡單，為藍(lán)刺頭多糖的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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