不同顏色類群芒果的ISSR分析

張 宇，唐志鵬 ，高 興，楊培麗，范琪祺，黃國弟

（1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004； 2.廣西壯族自治區(qū) 亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530002）

亞洲國家的消費(fèi)者習(xí)慣上喜歡果皮呈淡黃色的芒果，而歐美各國的消費(fèi)者則喜歡果皮呈紅色或粉紅色的芒果。隨著我國芒果種植業(yè)的發(fā)展，芒果品種逐漸豐富，國內(nèi)消費(fèi)者對外觀艷麗的紅芒開始感興趣。因此，選育出果實(shí)外觀艷麗的芒果品種是今后開展新品種選育的發(fā)展方向之一[1]。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和果皮顏色，可將芒果分為紅芒品種群、金芒品種群、青芒品種群[2]。紅象牙（紅色果皮）是從象牙芒（青黃色果皮）實(shí)生后代中選育出來的，兩者的相似系數(shù)高達(dá)0.933，是研究果皮顏色相關(guān)的連鎖標(biāo)記較理想的試材[3]。通過芒果種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD分析發(fā)現(xiàn)，1條約550 bp的特異性譜帶在16個(gè)供試的紅色果皮芒果品種中有15個(gè)缺失此帶，推測這一譜帶可能是與果皮顏色相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記[3-4]。芒果的果色表達(dá)可能受主效基因控制，果皮出現(xiàn)紅色可能是因?yàn)槿笔Я伺c某顏色有關(guān)的基因，這與蘋果果皮的顏色由單基因控制紅色顯性性狀類似[5]。紅色果皮的芒果起源于印度單胚種群，而黃色果皮的芒果起源于印度支那多胚種群[6-7]。國內(nèi)外對芒果果皮顏色性狀遺傳機(jī)理的研究較其它植物少[1]，同時(shí)未見借助ISSR（Inter simple sequence repeat）標(biāo)記來選育不同果皮顏色芒果品種的報(bào)道。若將ISSR標(biāo)記技術(shù)用于芒果果皮顏色資源評價(jià)，可加快芒果果色遺傳研究和遺傳改良的進(jìn)程[8]。文中以芒果市場和芒果生產(chǎn)發(fā)展的需要為原則，利用ISSR標(biāo)記法[9-15]，對不同顏色類群的芒果進(jìn)行了遺傳多樣性分析，旨在為今后開展芒果定向育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的8個(gè)芒果品種全部采集自廣西大學(xué)標(biāo)本園，各芒果品種的基本情況如表1所示。

表1 供試遺傳多樣性分析的不同顏色類群的芒果品種情況Table 1 Status of mango cultivars with different colors peels used for genetic diversity analysis

1.2 方 法

采集上述8個(gè)芒果品種的10片嫩紅且長勢良好的葉片作為試材，裝入塑料袋封口后置于有冰塊的冰壺中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，用蒸餾水清洗后用濾紙吸干表面水分，保存于－25℃冰箱中備用[16-17]。稱取0.5 g葉片，用液氮研磨至粉末狀，采用張宇等的改良CTAB法提取每個(gè)樣本的總DNA[18]。PCR擴(kuò)增及檢測參考張宇等[18]的方法進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，所得PCR總反應(yīng)體系20.0 μL，其中：ddH2O 15.9 μL、模板 1.0 μL、5 U/μL Taq酶（含 Mg2+）0.2 μL、10 mmol/L 引物 0.4 μL、堿基 0.5 μL、10×Buffer 2.0 μL；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃ 1 min，48～ 51 ℃退火50 s（溫度不同引物的退火溫度不同），72 ℃1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)引物；72 ℃延伸8 min，在4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測、拍照。選擇加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia，UBC）公布的引物，進(jìn)行序列設(shè)計(jì)與合成，引物濃度一般為0.2 μmol/L。利用NTsys2.10軟件進(jìn)行聚類分析研究，在凝膠電泳中，按擴(kuò)增條帶的有無記數(shù)，當(dāng)出現(xiàn)某一擴(kuò)增帶時(shí)，賦值為“1”，不存在時(shí)賦值為“0”。在Excel表中將相對分子質(zhì)量數(shù)值轉(zhuǎn)化為1、0矩陣，再用NTsys2.10軟件深入分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物篩選

以臺農(nóng)1號、金煌芒、金穗芒、桂熱82號、四季蜜芒、愛文芒、凱特芒、紅芒6號等8個(gè)芒果品種為模板，選擇5條適合不同顏色類群芒果的遺傳多樣性分析的ISSR引物，如表2所示。

表2 不同顏色類群的遺傳多樣性分析引物的序列和退火溫度?Table 2 Primer sequences and annealing temperatures in genetic diversity analysis of different color groups

2.2 多樣性表現(xiàn)

分別將引物UBC-840、UBC-857、UBC-864、UBC-868、UBC-890用于不同顏色類群芒果的遺傳多樣性分析，引物UBC-864可將8個(gè)供試芒果品種分為兩類：臺農(nóng)1號、金穗芒、金煌芒、桂熱82、四季蜜芒這5者之間的親緣關(guān)系較近；凱特芒、愛文芒、紅芒6號與上述5個(gè)芒果品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

UBC-864對8個(gè)芒果品種PCR擴(kuò)增的電泳圖譜如圖1所示。從圖1可看出：凱特芒、愛文芒、紅芒6號在大小約750 bp和2 000 bp位置處有清晰的同源性譜帶，而臺農(nóng)1號、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒、桂熱82號在此處無同源性譜帶；臺農(nóng)1號、金穗芒、四季蜜芒、桂熱82號在約1 100 bp位置處有明顯的同源性譜帶，而金穗芒在此處無同源性譜帶，推測金穗芒較其它4個(gè)供試芒果品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 UBC-864對8個(gè)芒果品種PRC擴(kuò)增的電泳圖Fig. 1 Electrophorogram of PCR amplified production of eight mango cultivars by UBC-864 primer

2.3 多態(tài)性表現(xiàn)

利用5條擴(kuò)增穩(wěn)定、清晰、多態(tài)性好的ISSR引物，對供試的8個(gè)芒果品種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如表3所示。5條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出51條譜帶，其中多態(tài)性譜帶41條，多態(tài)率在76.9%～87.5%之間，平均多態(tài)率達(dá)80.4%，每一個(gè)隨機(jī)引物產(chǎn)生9～13條譜帶。

表3 ISSR引物和多態(tài)性分析Table 3 ISSR primers and polymorphic analysis

UBC-857對8個(gè)芒果品種PCR擴(kuò)增的電泳圖如圖2所示。UBC-857擴(kuò)增譜帶的大小分布在400～3 200 bp，集中分布在600～1 031 bp。8個(gè)供試品種共產(chǎn)生位點(diǎn)數(shù)58個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)55個(gè)，平均位點(diǎn)數(shù)7.25個(gè)。臺農(nóng)1號、金穗芒、金煌芒擴(kuò)增出較多的譜帶，四季蜜芒與桂熱芒82號相對擴(kuò)增譜帶較少，8個(gè)供試芒果品種的遺傳差異較大。

2.4 聚類分析

圖2 UBC-857對8個(gè)芒果品種PCR擴(kuò)增的電泳圖Fig. 2 Electrophorogram of PCR amplified production of eight mango cultivars by UBC-857 primer

圖3 8個(gè)芒果品種的ISSR聚類分析樹狀圖Fig. 3 Dendrogram of eight mango cultivars by ISRR cluster analysis

對在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中能穩(wěn)定出現(xiàn)的差異性譜帶進(jìn)行了分析，用NTsys2.10軟件進(jìn)行譜帶統(tǒng)計(jì)，用UPGMA法構(gòu)建了品種之間的分子系統(tǒng)樹狀圖。最終選定UBC-840、UBC-857、UBC-864、UBC-868、UBC-890共5條擴(kuò)增穩(wěn)定、清晰、多態(tài)性強(qiáng)的引物對供試的8個(gè)芒果品種進(jìn)行ISSR-PCR分析，如圖3所示。結(jié)果顯示，供試的8個(gè)芒果品種間的相似系數(shù)變化范圍為0.43～0.92。以0.52作為相似系數(shù)的分界點(diǎn)，可把8個(gè)芒果品種分為2大類，第1類包括臺農(nóng)1號、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒和桂熱82；第2類包括凱特芒、愛文芒和紅芒6號；以0.78作為相似系數(shù)的分界點(diǎn)，2個(gè)大類又可各自分為2個(gè)小類，共4個(gè)小類。其中紅芒6號有別于愛文芒、凱特芒單獨(dú)為1類；金穗芒有別于臺農(nóng)1號、金煌芒、四季蜜芒、桂熱82單獨(dú)為1類。依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法，以果實(shí)的果皮顏色為第一特征分類，芒果可分為紅芒品種群、金芒品種群、青芒品種群[2]。ISSR聚類分析的結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法比較吻合，說明ISSR分子標(biāo)記具有較強(qiáng)的可靠性。

3 結(jié)論與討論

表觀遺傳在植物適應(yīng)環(huán)境變化的過程中起到了重要作用。表觀遺傳機(jī)理是非常復(fù)雜的。植物可以通過表觀遺傳來調(diào)控基因表達(dá)、對轉(zhuǎn)基因進(jìn)行修飾、建立新的等位基因、調(diào)控基因組重排和轉(zhuǎn)座子活性、改變基因組DNA序列的進(jìn)化速率來適應(yīng)環(huán)境壓力[19]。當(dāng)植物遇到環(huán)境壓力時(shí)，表觀遺傳的修飾程度會(huì)發(fā)生改變。這種改變一部分是可以遺傳的，一部分會(huì)因?yàn)閴毫Φ娜コ谕淮?xì)胞中發(fā)生回復(fù)[20]。目前，植物中的表觀遺傳研究相對于動(dòng)物來說是比較少的，研究對象也主要集中在擬南芥[21-22]、水稻[23]等模式植物上，而文中選擇以目前研究較少的芒果為試材，采用ISSR標(biāo)記、運(yùn)用NTsys軟件對多個(gè)芒果品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析。引物UBC-840、UBC-857、UBC-864、UBC-868、UBC-890可用于芒果不同顏色類群的遺傳多樣性分析，擴(kuò)增多態(tài)率達(dá)80.4%，供試材料之間存在著豐富的遺傳多樣性。UBC-864將8個(gè)供試品種分為2類：凱特芒、愛文芒、紅芒6號在約750 bp和2 000 bp處有同源性譜帶，臺農(nóng)1號、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒、桂熱82在此處無譜帶；臺農(nóng)1號、金穗芒、四季蜜芒、桂熱82在約1 100 bp處有同源性譜帶，而金穗芒在此處同源性譜帶模糊暗淡，推測金穗芒較其它4個(gè)供試芒果品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。供試芒果品種間的相似系數(shù)范圍為0.43～0.92。以0.52作為相似系數(shù)的分界點(diǎn)，可把8個(gè)芒果品種分成2大類。以0.78作為相似系數(shù)的分界點(diǎn)，這2大類又可分為4小類。紅芒6號有別于愛文芒和凱特芒而單獨(dú)分為一類，金穗芒有別于臺農(nóng)1號、金煌芒、四季蜜芒和桂熱82而單獨(dú)分為一類。2大類中，臺農(nóng)1號、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒、桂熱82號屬于青色品種群；凱特芒、愛文芒、紅芒6號屬于紅色品種群。按照果皮顏色為第一特征的形態(tài)學(xué)分類，芒果分為紅色品種群、金色品種群和青色品種群[2]。ISSR聚類分析與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果表現(xiàn)一致。當(dāng)然，文中選用的試材只有8個(gè)芒果品種，不能代表全部芒果果皮顏色的所有遺傳信息，且沒有順利完成對特異性譜帶的回收測序。因此，要從分子生物學(xué)的角度尋找與芒果果皮顏色性狀相關(guān)的遺傳序列，還需要進(jìn)一步開展更深入的研究。

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