錐栗SRAP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

向 暉 ，袁德義 ，b，賈寶光

（中南林業(yè)科技大學(xué)a. 經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

錐栗Castanea henryi（Skan） Rehd. et Wils.為我國特有種[1]，屬殼斗科栗屬植物，俗稱榛子，主要分布在我國長江以南的福建、浙江、湖南等近14個省區(qū)內(nèi)。錐栗營養(yǎng)豐富，具有健脾胃、補腎強體等功用[2]，其主干通直，材質(zhì)堅實，耐水濕，被廣泛應(yīng)用于建筑、造船、家具制造等行業(yè)[3]，具有很好的經(jīng)濟價值和利用前景[4]。目前，關(guān)于錐栗的研究多限于資源調(diào)查、新品種培育、果實性狀分析等方面，可對錐栗分子生物學(xué)方面的研究報道卻較少[3]，而利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對錐栗進行的研究還未見諸報道。

SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism，相關(guān)序列擴增多態(tài)性）技術(shù)是美國加州大學(xué)蔬菜作物系的 Li 與 Quiros[5]于 2001 年在蕓薹屬植物中開發(fā)出來的，是一種基于PCR 的新型分子標(biāo)記技術(shù)。它主要通過獨特的引物設(shè)計對開放閱讀框（ORFs）進行擴增[6]，通過上下游引物的結(jié)合，可同時對外顯子、內(nèi)含子和啟動子區(qū)域進行擴增，且能擴增出特異性[7]。因為不同個體或物種的內(nèi)含子、啟動子和間隔序列不同，故其擴增的多態(tài)性高[8-9]；同時，SRAP所需 DNA 的量少而純度低，操作簡單且重復(fù)性好[10]。因此，本研究采用單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的研究方法，對錐栗的SRAP反應(yīng)體系進行了優(yōu)化試驗，以期為進一步研究錐栗種質(zhì)資源的遺傳多樣性及分子輔助育種奠定基礎(chǔ)，也為其他物種的相關(guān)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試樣品采自不同野生錐栗單株剛萌發(fā)的嫩葉，硅膠保存帶回實驗室，再置于－80 ℃的低溫冰箱中保存以備用。樣品信息見表1。

1.2 主要試劑及儀器

PCR擴增所需的Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、10XPCR Buffer（含Mg2+15 mmol/L）均購自TaKaRa生物工程有限公司；DNA marker（DL5000） 購自Solarbio科技有限公司；電泳所用Tris、 瓊脂糖等主要試劑均為國產(chǎn)分析純。SRAP引物由華大基因公司合成，所用引物序列有Me2、Me3、Me5、Em1、Em2、Em4，引物信息詳見表2。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.3 試驗方法

1.3.1 錐栗總DNA的提取與檢測

樣品總DNA的提取采用改良的CTAB法[11-12]，試劑盒由天根生化科技有限公司提供，按盒內(nèi)說明書步驟提取DNA。產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度，最后將DNA濃度稀釋至10 ng/μL，于－20 ℃的冰箱中保存。

1.3.2 SRAP基礎(chǔ)體系及擴增程序

參照Li等人[5]開發(fā)設(shè)計的 SRAP 擴增體系及程序，隨機選擇樣品1號與引物Me2- Em1組合進行擴增。

基礎(chǔ)體系為：總體系 20 μL，包括 10 ng/μL 模板 DNA 4 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，10×Taq Buffer 2 μL，10 μmol/L 的上游引物、下游引物各 1 μL， ddH2O 10.2 μL。

擴增程序為： 94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃、1 min，35 ℃ 、1 min，72 ℃、1 min，共5個循環(huán)；94 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，于4 ℃下保存。

1.3.3 SRAP體系單因素優(yōu)化試驗設(shè)計

參照基礎(chǔ)體系，設(shè)8個試驗水平（即8個濃度梯度），就不同濃度的模板DNA、Taq 酶、Mg2+、引物、dNTP對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況進行了單因素試驗，以優(yōu)化基礎(chǔ)反應(yīng)體系，從而找出各因素的最佳反應(yīng)參數(shù)。其總體系為20 μL，各影響因子的濃度梯度如表3所示。

表3 SRAP體系優(yōu)化單因素試驗設(shè)計Table 3 Design of single factor test for SRAP-PCR system optimization

1.3.4 SRAP體系正交優(yōu)化試驗設(shè)計

參照單因素優(yōu)化試驗得到的最優(yōu)反應(yīng)參數(shù)，對模板DNA濃度、Taq 酶濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度、引物濃度這5 個因素進行了4 個水平的L16（45）正交優(yōu)化試驗，試驗設(shè)3次重復(fù)，正交試驗設(shè)計分別見表4與表5。再將正交試驗結(jié)果與單因素試驗結(jié)果進行對比分析，最終選出了適合錐栗的SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系。

表4 SRAP反應(yīng)體系的試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of SRAP-PCR reaction system

表5 SRAP體系優(yōu)化正交試驗設(shè)計L16(45)Table 5 Orthogonal design L16(45) of SRAP-PCR system optimization

1.3.5 產(chǎn)物檢測

將PCR 擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓110 V，電泳 30～40 min，Gelstain 核酸凝膠染料染色， 置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。

1.4 錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系穩(wěn)定性的檢測

隨機抽取5個模板（2～6號）和2個引物組合（即Me3-Em2與Me5-Em4），對最終確定的錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進行了檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 模板DNA濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

DNA作為PCR反應(yīng)的模板，是體外擴增反應(yīng)的基礎(chǔ)。模板濃度過低或過高都會影響擴增試驗的結(jié)果：濃度過低，擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定或無擴增產(chǎn)物；濃度過高可能增加非特異性產(chǎn)物[13]。模板DNA濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況如圖1 所示。由圖1可知，模板濃度的變化對錐栗SRAP反應(yīng)的影響不大。20 μL體系中，DNA含量在5～100 ng之間，均可擴增出條帶，但在10 ng以下和85 ng以上時，擴增出的條帶模糊，條帶數(shù)少； 處于25～70 ng之間的條帶穩(wěn)定，條帶數(shù)多且清晰可辨。結(jié)合穩(wěn)定度與樣品用量等方面考慮，初步選擇模板DNA含量的最適濃度為40 ng。

圖1 模板DNA濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 1 Effect of template DNA concentration on SRAP-PCR

2.1.2 Taq DNA聚合酶濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

Taq DNA聚合酶濃度對PCR擴增有著顯著的影響。濃度過低影響新鏈合成效率，甚至無法擴增；濃度過高則易造成浪費，產(chǎn)生非特異性條帶。本試驗設(shè)置了1.0～4.5 U 8個梯度以觀測TaqDNA聚合酶濃度對錐栗SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況，試驗結(jié)果如圖2 所示。從圖2中可以看出，Taq酶含量在2.5 U以下時，擴增效果較好；其含量超過2.5 U時，擴增出的條帶既模糊又不穩(wěn)定。綜合考慮試驗結(jié)果和經(jīng)濟因素，初步選定的20 μL體系中Taq DNA聚合酶的最適濃度為2.0 U。

圖2 Taq DNA聚合酶濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 2 Effect of Taq DNA polymerase concentration on SRAP-PCR

2.1.3 Mg2+濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

作為Taq酶的輔助因子，Mg2+濃度不僅影響Taq酶活性，還能與反應(yīng)液中的dNTP、模板DNA及引物結(jié)合，影響引物與模板的結(jié)合效率和模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度以及產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成[14]。Mg2+濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況如圖3 所示。圖3顯示，當(dāng)Mg2+濃度為1.4～2.8 mmol/L時，Mg2+濃度對錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響不明顯；當(dāng)其濃度＞2.4 mmol/L時，擴增出的條帶數(shù)減少；當(dāng)其濃度超出2.8 mmol/L時，幾乎無法擴增出條帶；而當(dāng)其濃度為1.8 mmol/L時，擴增效果最好。

2.1.4 dNTP濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

圖3 Mg2+濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 3 Effect of Mg2+ concentration on SRAP-PCR

dNTPs與DNA一樣，是PCR擴增的基礎(chǔ)，作為原料參與新鏈DNA的合成，對PCR反應(yīng)有著十分顯著的影響。dNTPs濃度過高會使堿基錯配率和實驗成本增加；而其濃度過低則影響合成效率，產(chǎn)量下降，甚至導(dǎo)致產(chǎn)物單鏈化。因此，適宜的dNTP濃度對PCR反應(yīng)至關(guān)重要。dNTP濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況如圖4 所示。由圖4可知，當(dāng)dNTP濃度低于0.16 mmol/L時，擴增出的條帶亮度明顯下降；當(dāng)其濃度低于0.1 mmol/L時，擴增出的條帶數(shù)量減少且模糊不清；而其濃度為0.16～0.28 mmol/L時，擴增效果區(qū)別不大，條帶明亮清晰。本試驗初步選定的最適于錐栗SRAP反應(yīng)的dNTP濃度為0.25 mmol/L。

2.1.5 引物濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

圖4 dNTP濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 4 Effect of dNTP concentration on SRAP-PCR

引物與DNA模板特異性結(jié)合，引導(dǎo)新鏈的合成，在PCR擴增中，起著十分重要的作用。引物濃度關(guān)系到擴增產(chǎn)物的質(zhì)量，濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，增加引物二聚體的形成幾率；濃度太低則無法進行有效擴增[15]。試驗設(shè)置8個引物梯度，結(jié)果如圖5所示。在引物濃度為0.3～1.0 μmol/L區(qū)間內(nèi)，均能擴增出條帶，且其多態(tài)性好，但濃度低于0.5 μmol/L和大于0.9 μmol/L時，條帶黯淡不清晰。因此，在保證條帶穩(wěn)定且清晰的前提下，最適于錐栗SRAP反應(yīng)的引物濃度可為0.6 μmol/L。

2.2 正交試驗結(jié)果的直觀分析

L16（45）正交試驗的電泳結(jié)果如圖6所示。按照遺傳多樣性分析要求，參考何正文等人[16]的方法，對PCR擴增結(jié)果從高到低依次打分?？偡?6分，條帶數(shù)量豐富、清晰度高，背景低的最佳產(chǎn)物記為16分，與此相反，最差的則記為1分。3次重復(fù)試驗獨立評分，結(jié)果見表5。根據(jù)得分平均值求出每個因素同一水平下的試驗值之和Ki（即ΣKi，i＝1,2,3,4）以及每一因素水平下的數(shù)據(jù)平均值Ki（即Ki＝Ki/4），并求出同一因素不同水平間平均值的極差R值（即R＝Kmax－Kmin，Kmax為單個試驗因素中Ki的最大值；Kmin為單個試驗因素中Ki的最小值），結(jié)果見表6。

圖5 引物濃度對SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 5 Effect of primer concentration on SRAP-PCR

圖6 正交試驗擴增結(jié)果Fig. 6 Amplification results of orthogonal test

表 6 正交結(jié)果的直觀分析Table 6 Intuitive analysis of orthogonal result

結(jié)合圖6與表5分析，處理組合1、2、7、14的得分很低，條帶效果不理想。其中處理組合1、2的條帶量少且黯淡，擴增產(chǎn)物少，其原因是模板、Taq酶濃度、dNTP濃度比較低，新鏈合成效率不高；處理組合7的條帶量較少，其原因是Mg2+濃度過高，影響了Taq DNA聚合酶的活性，同時dNTP濃度低，影響了產(chǎn)物的合成；處理組合14條帶少，這可能因為模板和引物濃度過高，而Taq酶濃度和dNTP濃度又過低。參考表5的評分，綜合3次重復(fù)試驗結(jié)果，考慮穩(wěn)定性、條帶數(shù)、條帶亮度及清晰度，初步選擇處理組合15為最適反應(yīng)體系。

對正交試驗結(jié)果進行直觀分析得出，影響錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的5個重要因素為模板DNA濃度、Taq 酶濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度、引物濃度，這5個因素對PCR反應(yīng)結(jié)果的影響效力存在明顯差異。極差R值反映了每個因素對SRAP反應(yīng)的影響程度，R值越大，表示該因素對試驗結(jié)果影響越顯著[15]。表6說明，RdNTP濃度＞RTaq酶濃度＞R引物濃度＞RMg2+濃度＞R模板濃度，即影響因子dNTP濃度對錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響最大，其次為Taq酶濃度，對其影響最小的是模板DNA濃度。Ki值反映了各因素不同水平對反應(yīng)體系的影響情況，Ki值越大，表示對應(yīng)的梯度水平越好，對反應(yīng)體系的影響效果越佳。各試驗因素不同試驗水平對錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響情況如圖7 所示。由圖7可知，模板DNA濃度的最佳水平為40 ng，Taq酶濃度的最佳水平為2.0 U，Mg2+濃度的最佳水平為1.8 mmol/L，dNTP濃度的最佳水平為0.28 mmol/L，引物濃度的最佳水平為0.8 μmol/L。但由此得出的5因素的最佳水平組合，在正交設(shè)計表中并沒有出現(xiàn)。另一方面，正交設(shè)計中得分最高的處理組合15，與此最佳組合十分接近，兩者只有模板DNA濃度與引物濃度不一致，而極差R值說明，這兩個因素對錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響并不大，因此，綜合比較分析之前的單因素試驗結(jié)果，最終確定的錐栗SRAP-PCR反應(yīng)最佳體系為：20 μL體系中，模板DNA濃度40 ng，Taq酶濃度2.0 U，Mg2+濃度1.8 mmol/L，dNTP濃度0.28 mmol/L，引物濃度 0.6 μmol/L。

圖7 各試驗因素不同試驗水平對錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 7 Effects of different test levels of each test factor on SRAP-PCR in C. henryi

2.3 最優(yōu)體系穩(wěn)定性檢測

隨機抽取5個模板與2個引物組合對最終確定的錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進行檢測，結(jié)果如圖8所示。圖8中，編號為1～5的試驗所用引物組合為Me3- Em2，所用模板依次為模板2、模板3、模板4、模板5、模板6；編號為6～10的試驗所用引物組合為Me5- Em4，所用模板依次為模板2、模板3、模板4、模板5、模板6。擴增產(chǎn)物條帶豐富、清晰可辨，穩(wěn)定重復(fù)性好，表明最終優(yōu)化后的該體系適用于錐栗SRAP分子標(biāo)記試驗。

3 討 論

圖8 錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測結(jié)果Fig. 8 Test result of stability of the optimal SRAP-PCR system in C. henryi

SRAP是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)，由美國加州大學(xué)蔬菜系的兩位博士Li和Quiros于2001年在發(fā)表的Springer-Verlag雜志中提出[5]，其操作簡單，重復(fù)性好，具有高頻率的共顯性，且不需要預(yù)知物種的序列信息，擴增條帶多態(tài)性和信息量豐富，易于分離測序[10]。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，RAPD存在重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，SSR檢測的位點較少、引物開發(fā)費時且成本高，AFLP分析程序復(fù)雜、成本昂貴等問題。而SRAP彌補了上述各項標(biāo)記的不足，并以其獨有的優(yōu)點已成為一種比較理想的分子標(biāo)記技術(shù)[17]。目前，SRAP技術(shù)已成功運用于甜菜[18]、色蕉[19]、牡丹[20-21]、野牛草[22]、甜瓜[10]、水稻、馬鈴薯、萵苣、白菜、大豆、油菜、大蒜、蘋果、生菜、柑橘、櫻桃、芹菜等植物的研究中[23-24]，但還沒有人將此標(biāo)記方法應(yīng)用于錐栗研究中。因此，建立一套錐栗SRAP-PCR反應(yīng)最優(yōu)體系，可為錐栗的后續(xù)分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

雖然SRAP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于其他植物的研究中，但同樣的方法在不同植物中的應(yīng)用會有差異，如鄭婷婷[25]、郭大龍[26]、史紅麗[27]、徐穎[28]等人的研究結(jié)果均不同。由此可見，對錐栗進行SRAP反應(yīng)體系的優(yōu)化試驗是十分必要的。

當(dāng)前，常見的分子標(biāo)記體系的優(yōu)化方法主要有兩種：一種是單因素試驗法；一種是正交試驗法。兩種方法各有利弊。單因素試驗設(shè)計簡單，操作誤差小[29]，可快速而又直觀地表現(xiàn)出各因子對反應(yīng)體系的影響情況，但不能體現(xiàn)出各因素之間的互作效應(yīng)[13]。正交試驗可以很好地反映出各影響因素之間的互作效應(yīng)，具有布點均衡、試驗次數(shù)少、結(jié)果直觀等優(yōu)點[30]，但對其結(jié)果的評價往往帶有主觀性，試驗結(jié)果直接受評分高低的影響，缺乏一定的可靠度。因此，本試驗采用單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的方法進行綜合分析，可揚長避短，能更有效、更準(zhǔn)確地得出錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系，保證體系的穩(wěn)定性。

本研究分析得出，PCR的影響因素之間并不是獨立而是相互起作用的，但各因素的影響力度不一樣。DNA與dNTP一樣，是PCR擴增的基礎(chǔ)。dNTP濃度過高會增加堿基的錯配率；其濃度過低則影響合成效率，甚至導(dǎo)致產(chǎn)物單鏈化。但是，試驗結(jié)果表明，錐栗SRAP反應(yīng)對DNA的要求不高，而對dNTP濃度的要求嚴(yán)格。另一方面，Mg2+作為Taq酶活性的影響因子，不僅干擾Taq酶參與反應(yīng)的效率，還能與其他影響因子結(jié)合，從而影響反應(yīng)進程。而文中的試驗結(jié)果表明，Mg2+濃度在1.4～2.8 mmol/L 的范圍內(nèi)時，其對反應(yīng)的影響不大，因此，此濃度范圍是適合錐栗SRAP標(biāo)記的。比較兩種分析方法，單因素試驗中，Taq酶濃度和dNTP濃度對PCR擴增的影響較大，而模板DNA濃度的影響較??；正交試驗中，根據(jù)極差R值同樣可以得出，影響較大的因素仍是dNTP濃度和Taq酶濃度，其次是引物濃度，模板濃度的影響最小，這與單因素試驗結(jié)果高度一致。相比其他植物而言[31-33]，采用兩種方法研究的結(jié)果高度一致的情況并不多見，這在一定程度上也凸顯了錐栗的特殊性，以及不同物種試驗前體系優(yōu)化的必要性。在具體的試驗因素與水平上，單因素試驗分析所得的模板濃度、引物濃度、dNTP濃度和正交試驗分析所得的結(jié)果并不完全一致，這可能與PCR反應(yīng)本身的不穩(wěn)定性和主觀評分有關(guān)，由于兩種方法的結(jié)果在總體趨勢上保持高度一致，因而具體試驗因素與水平的差異并不影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠度，最終優(yōu)化體系的驗證試驗也證實了此結(jié)論。最后，本研究得出的最優(yōu)體系組合，即 20 μL體系中，模板DNA濃度40 ng，Taq酶濃度 2.0 U，Mg2+濃度 1.8 mmol/L，dNTP濃度0.28 mmol/L，引物濃度0.6 μmol/L，可為錐栗進一步的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、親緣關(guān)系及種質(zhì)資源的鑒定與研究奠定了基礎(chǔ)，也為其他物種的分子標(biāo)記研究提供了理論參考。

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