兩種國產(chǎn)乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑的檢測效能評價*

王潔，常靜霞，張怡青，孟運(yùn)運(yùn)，汪茂榮

·乙型肝炎·

兩種國產(chǎn)乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑的檢測效能評價*

王潔，常靜霞，張怡青，孟運(yùn)運(yùn)，汪茂榮

目的比較兩種國產(chǎn)不同核酸提取方法定量檢測乙型肝炎病毒（HBV）核酸試劑的檢測效能。方法選擇經(jīng)抗病毒治療且HBV DNA載量在＜1x104IU/ml的乙型肝炎患者血清標(biāo)本36份，采用兩種國產(chǎn)HBV核酸定量檢測試劑盒平行檢測HBV DNA，對陽性血清進(jìn)行梯度稀釋后再檢測，從定量線性范圍、準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性等方面比較兩種試劑的差異。結(jié)果在36例臨床血清中，14份經(jīng)科華試劑檢測的結(jié)果為＜500 IU/ml，而圣湘試劑檢測的結(jié)果仍＞1.00×103IU/ml；對其中獲得檢測數(shù)據(jù)的31份標(biāo)本進(jìn)行兩種試劑檢測結(jié)果的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)一致性較好（r=0.817，P＜0.05）；兩種方法檢測乙型肝炎患者血清HBV DNA的陽性率分別為55.6%和94.4%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=12.07，P=0.000)；對強(qiáng)陽性血清進(jìn)行梯度稀釋后定量檢測顯示，兩種試劑檢測水平的平均值與理論水平的線性相關(guān)性較好（湖南圣湘r=0.999，上?？迫Ar=0.992），但圣湘所有檢測的相對偏差均在±0.3logIU/ml之內(nèi)，而科華有兩次檢測的相對偏差超出了±0.3logIU/ml范圍，提示圣湘試劑檢測結(jié)果更穩(wěn)定，使用納米磁珠核酸提取法的檢測結(jié)果較煮沸法更加準(zhǔn)確。結(jié)論以納米磁珠為提取核酸方法不僅具有更廣的線性范圍，同時可顯著提高國產(chǎn)HBV DNA檢測試劑的靈敏度和準(zhǔn)確性。

乙型肝炎病毒；核酸；國產(chǎn)檢測試劑盒；效能

我國屬于HBV感染高流行區(qū)，最近一次的全國乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查表明，HBsAg攜帶率已由1992年的9.75%降至2006年的7.18%，但總?cè)藬?shù)仍超過9000萬[1～3]，占全世界的1/4。我國已正式批準(zhǔn)用于抗病毒治療的核苷類藥物有拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替比夫定。最重要和最直觀的抗病毒療效評價方法就是HBV核酸水平的顯著下降，甚至轉(zhuǎn)陰[4]。目前，國內(nèi)普遍用于HBV核酸檢測的方法為采用Taqman探針技術(shù)為基礎(chǔ)的實(shí)時熒光定量PCR法，盡管試劑質(zhì)量得到很大的改進(jìn)，但在靈敏度、準(zhǔn)確性及重復(fù)性等方面與進(jìn)口優(yōu)質(zhì)試劑相比仍存在較大的差距。國產(chǎn)商品化HBV核酸檢測試劑盒仍是基于即將廢除的煮沸法提取核酸，最低檢測限在500～1000 IU/ml之間，遠(yuǎn)不能滿足臨床準(zhǔn)確診斷的需求。國際主流HBV DNA定量檢測試劑的最低檢測限已可達(dá)到9 IU/ml，如雅培公司的Real-Time HBV DNA assay。與國際主流試劑相比，國產(chǎn)試劑的檢測靈敏度僅相差一個對數(shù)級。當(dāng)HBV DNA處在1000 IU/ml以下水平時，國產(chǎn)試劑檢測的結(jié)果對判斷抗病毒治療的療效就有些困難[5]。然而，使用進(jìn)口HBV核酸檢測試劑的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國產(chǎn)試劑。在國家“十一五”和“十二五”傳染病防治重大專項等國家項目支持下，基于磁珠法的檢測方法已逐漸應(yīng)用于核酸（DNA和RNA）等多種生物物質(zhì)的分離與純化[6～8]，與傳統(tǒng)非磁性方法相比，步驟簡單，無需離心，能夠真正實(shí)現(xiàn)高通量自動化核酸提取，因而應(yīng)用磁珠法核酸提取的國產(chǎn)HBV DNA定量試劑已成為主流研發(fā)的方向。該方法能夠除去大多數(shù)干擾PCR的抑制因子，如蛋白質(zhì)、多糖、酚類等物質(zhì)[9]，降低假陰性率。我實(shí)驗(yàn)室比較了湖南圣湘生物科技有限公司研發(fā)的新型HBV DNA定量試劑盒（磁珠法）和上?？迫A生物工程股份有限公司提供的HBV DNA定量試劑盒（煮沸法）的檢測效能，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源2013年1月～3月在我院接受抗病毒治療的乙型肝炎患者36例，男24例，女12例；年齡19～72歲。所有患者的診斷均符合2010年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[10]。血標(biāo)本無溶血、無脂血，抗-HAV、抗-HCV、抗-HEV、抗-HIV均為陰性。

1.2 血清HBV DNA檢測使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）7300型實(shí)時熒光定量PCR儀和兩種國產(chǎn)乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（湖南圣湘和上?？迫A）。以無抗凝劑干燥管抽取受試者靜脈血4 mL，靜置30 min，以3000r/m離心10 min，將血清轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管，-20℃保存。應(yīng)用上?？迫A定量試劑檢測：嚴(yán)格按照說明書中“煮沸法-適用非毛細(xì)反應(yīng)管類PCR反應(yīng)管的操作步驟”進(jìn)行操作，用ABI 7300 PCR儀自動擴(kuò)增和檢測核酸。該定量試劑對HBV DNA的最低檢出限為500IU/ml。結(jié)果判定：HBV循環(huán)數(shù)（threshold cycles，Ct）＞檢測上限或未測出Ct數(shù)值為陰性，報告為＜500IU/ml或低于檢測下限；血清HBV DNA≧500IU/ml為陽性，檢測結(jié)果在500～1.0×108IU/ml，報告具體數(shù)值；對＞1.0×108IU/ml血清，則行進(jìn)一步稀釋，再檢測。應(yīng)用湖南圣湘定量試劑檢測：采用磁珠法提取血清HBV DNA，用ABI 7300 PCR儀自動擴(kuò)增和檢測核酸。該試劑盒設(shè)置有HBV DNA內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，為TaqMan探針5′末端標(biāo)記HEX熒光素，通過檢測內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品是否正常，來監(jiān)測待測樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性。同時設(shè)置有UNG酶+dUTP防污染措施，以排除假陽性結(jié)果。該試劑還設(shè)置有內(nèi)參比熒光ROX，用于校正加樣誤差和管間差異，以提高定量的準(zhǔn)確性。本試劑盒的最低檢測下限為10IU/ml。結(jié)果判定：血清HBV DNA≧20IU/ml為陽性。對測定值在20～2.0×109IU/ml之間的血清，直接報告結(jié)果；當(dāng)測定值＞2.0×109IU/ml時，報告注明＞2.0×109IU/ml。對需精確定量者，則對血清稀釋1000倍后，再復(fù)測；對測定值≧10而＜20IU/ml血清，同時內(nèi)標(biāo)檢測為陽性且Ct≦40，表明病毒載量低，測定值僅供參考；對測定值＜10IU/ml血清，同時內(nèi)標(biāo)檢測為陽性且Ct≦40，則報告HBV DNA水平低于試劑盒檢測下限。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSSl7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對兩種國產(chǎn)試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)性采用回歸方程和直線相關(guān)分析，對檢出陽性率進(jìn)行x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種試劑的檢測結(jié)果兩種國產(chǎn)試劑盒檢測36例患者血清HBV DNA載量情況見表1。

2.2 兩種不同核酸提取方法檢測HBV DNA相關(guān)性分析采用兩種試劑對36例臨床血清樣本進(jìn)行檢測，其中31例獲得具體結(jié)果，另5例為一種或兩種試劑檢測為陰性。對31例陽性血清結(jié)果取對數(shù)值，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，并獲得回歸方程，見圖1。

圖1 兩種試劑定量檢測HBV DNA結(jié)果的散點(diǎn)圖回歸方程：Y=0.67x+0.39，r=0.817，P＜0.05

2.3 兩種不同核酸提取方法檢測HBV DNA陽性率比較磁珠法（湖南圣湘）檢測的陽性率明顯高于煮沸法（上?？迫A，P＜0.05，表2）。

表1 兩種試劑測定HBV DNA結(jié)果（IU/ml）

表2 兩種試劑檢測HBV DNA陽性率（%）比較

2.4 強(qiáng)陽性血清經(jīng)梯度稀釋后的檢測結(jié)果分析對試劑盒提供的強(qiáng)陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品（4.00×107IU/ml）進(jìn)行稀釋后，采用兩種試劑各重復(fù)檢測2次，以評價兩種試劑檢測的準(zhǔn)確度。結(jié)果見表3。兩種試劑檢測水平的平均值與理論水平的線性相關(guān)性較好（湖南圣湘r=0.999和上?？迫Ar=0.992），但圣湘所有檢測的相對偏差均在±0.3 log IU/ml之內(nèi)，而科華有兩次檢測的相對偏差超出了±0.3 log IU/ml范圍，提示圣湘試劑檢測結(jié)果更穩(wěn)定。

表3 強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)血清經(jīng)稀釋后的檢測結(jié)果（lg IU／ml）分析

3 討論

HBV DNA定量檢測對于分析HBV感染的疾病進(jìn)展、抗病毒治療的療效評估及耐藥檢測均有重要意義。目前，國內(nèi)生產(chǎn)的HBV DNA定量試劑盒有20余種，這些試劑的檢測靈敏度和檢測范圍參差不齊，特別對于一些接受抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者，經(jīng)國產(chǎn)試劑盒檢測為“HBV DNA低于檢測下限”，但經(jīng)進(jìn)口試劑仍可檢測到HBV DNA，說明國產(chǎn)試劑的檢測靈敏度較低。

有文獻(xiàn)報道，在病毒水平為1.00×103～1.00×108IU/ml范圍內(nèi)，國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果的差異較小。本文發(fā)現(xiàn)81.7%的血標(biāo)本經(jīng)兩種試劑檢測結(jié)果一致?？傮w而言，科華試劑的檢測結(jié)果普遍比圣湘試劑的檢測結(jié)果低，在14例血標(biāo)本，科華試劑檢測的結(jié)果為＜500 IU/ml，而圣湘試劑仍能檢出定量水平（＞1.00×103IU/ml）。

通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低病毒載量時，不同國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果的差異較大，而湖南圣湘試劑表現(xiàn)出相對較高的靈敏度。兩者的主要差異在于核酸提取方法的不同，傳統(tǒng)的煮沸法提取核酸很可能造成核酸的損失，從而直接影響到檢測結(jié)果。對強(qiáng)陽性樣本經(jīng)梯度稀釋后進(jìn)行的定量檢測結(jié)果說明，圣湘試劑的定量結(jié)果更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定。

綜合評價，我們認(rèn)為在檢測HBV DNA時，采用磁珠分離法提取核酸優(yōu)于煮沸法。分析造成目前國內(nèi)常用的HBV DNA定量檢測試劑盒檢測質(zhì)量不高的原因主要有以下幾點(diǎn)：①加樣量的差異。進(jìn)口試劑以Roche和Abbott為例，兩者血漿用量通常為850μl和200～500μl，純化后的加樣量均為50μl，而國產(chǎn)試劑，血清或血漿用量為100μl，在行PCR時的上樣量僅為2μl，盡管這在一定程度上簡化了操作程序，但可能導(dǎo)致了試劑靈敏度的降低和檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。圣湘試劑盒在這一方面做了一些改進(jìn)，在一定程度上加大了血清用量和模板量，有利于陽性率的提高和結(jié)果的穩(wěn)定；②核酸提取方法的差異。國內(nèi)目前所采用的煮沸法，只是將核酸從病毒顆粒中釋放出來，離心后則吸取上清用于擴(kuò)增，中間并無任何純化步驟，這就使離心后的上清中存在一定量的干擾物質(zhì)，例如樣本中血紅蛋白和一些其他蛋白物質(zhì)等，而血紅蛋白可與聚合酶發(fā)生不可逆結(jié)合，抑制酶的活性，從而導(dǎo)致靈敏度降低，且影響試驗(yàn)的重復(fù)性，這也是目前主流國產(chǎn)試劑盒較大的弊端所在；③試劑的質(zhì)量控制不足。常用的國產(chǎn)試劑盒采用的是外標(biāo)，包括病毒外標(biāo)和質(zhì)粒外標(biāo)。雖然病毒外標(biāo)可以與待測樣本平行參與提取和擴(kuò)增過程，但卻不能做到每管均得到控制。質(zhì)粒外標(biāo)并不參與核酸的前處理過程，因而無法監(jiān)測核酸提取環(huán)節(jié)。圣湘采用的磁珠核酸提取法，能完全、特異地分離樣本中的核酸，大大提高純化效率及純度，去除標(biāo)本中蛋白及多糖類物質(zhì)的干擾，為后續(xù)檢測提供了質(zhì)量保證，加樣50μl也進(jìn)一步保證了樣本病毒的檢出，特別是在低水平樣本。同時，試劑盒采用的是內(nèi)標(biāo)，在試驗(yàn)的第一步樣本提取時即加入，直到最后一步的樣本擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了全程監(jiān)控，有效地避免了因提取或擴(kuò)增失敗導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。

由于本文只實(shí)驗(yàn)檢測了一些低病毒載量標(biāo)本，對于超高病毒載量（＞2.00×108IU/ml）血清標(biāo)本的檢測還有待于研究。但是，我們已經(jīng)看到了，將納米磁珠核酸提取法與國產(chǎn)試劑結(jié)合后的優(yōu)勢，因?yàn)檫@樣可以大大提高分析的靈敏度，擴(kuò)大了檢測的線性范圍，提高了陽性檢出率[5]。隨著抗HBV藥物的大規(guī)模推廣使用，HBV DNA水平是一個很重要的監(jiān)測指標(biāo)，但往往因?yàn)镠BV DNA檢測結(jié)果報告為“低于最低檢測限”，卻并不是病毒得到了完全清除的指標(biāo)，容易誤導(dǎo)臨床判斷。檢測本身對實(shí)驗(yàn)過程也提出了更高的要求，例如防止樣本的交叉污染、產(chǎn)物氣溶膠污染的控制等等。

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（收稿：2014-02-10）

（校對：陳從新）

Evaluation of two domestic kits for quantitative detection of serum hepatitis B virus nucleic acids

Wang Jie,Chang Jingxia,Zhang Yiqing,et al.Institute of Liver Disease，81st Hospital of PLA，Nanjing 210002，Jiangsu Province，China

ObjectiveTo evaluate the efficacy of two domestic kits using different nucleic acid extraction methods for quantitative detection of serum hepatitis B virus（HBV）nucleic acids.MethodsThirty-six serum samples from hepatitis B patients with HBV DNA levels＜1x104IU/ml after antiviral treatment were collected and HBV DNA was detected by kits from two pharmaceutical Co..The quantitative linear range，accuracy，sensitivity and specificity of each kits were evaluated and compared.ResultsOut of 36 serum samples，the HBV DNA levels in 14 were＜500 IU/ml by KELONG reagent，while they were＞1.00×103IU/ml by San Xiang reagent；There was a good correlation in 31 samples by the two reagents（r=0.817，P＜0.05）;The positive rates ofserum HBV DNA were 55.6%and 94.4%，respectively，by the two kit detection（x2=12.07，P=0.000）；We detected serum HBV DNA in some strong positive samples after serial dilution and the results showed a good linear correlation（San Xiang:r= 0.999，KELONG:r=0.992）；The relative deviations by San Xiang kit repetition was within±0.3logIU/ml，while it was beyond±0.3logIU/ml in two detections by KELONG.ConclusionsThe findings in this study suggests that the San Xiang reagent is more stable as it use nanometer magnetic extraction，which might be superior to boiling method for DNA extraction because the magnetic nanoparticle has wider liner ranger and significantly improves the sensitivity and accuracy of HBV DNA detection.

Hepatitis B virus；Nucleic acids；Domestic kits；Efficacy

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.04.009

國家十二五傳染病重大專項課題（編號：2012ZX09303-001-002）

210002南京市南京軍區(qū)解放軍第81醫(yī)院全軍肝病中心

王潔，女，35歲，醫(yī)學(xué)碩士，主管技師。主要從事病毒性肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷研究。E-mail:wangjiej@126.com

汪茂榮，E-mail:maorongwang@gmail.com