經(jīng)肝動(dòng)脈自體骨髓或臍帶血干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化患者的安全性和近期療效比較*

王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡國(guó)芳，陳瑞麗，楊興坤，張靜，馮淑賢

·肝硬化·

經(jīng)肝動(dòng)脈自體骨髓或臍帶血干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化患者的安全性和近期療效比較*

王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡國(guó)芳，陳瑞麗，楊興坤，張靜，馮淑賢

目的比較經(jīng)肝動(dòng)脈途徑注入自體骨髓干細(xì)胞或臍帶血干細(xì)胞治療失代償期肝硬化患者的安全性，以及對(duì)患者肝功能和凝血酶原活動(dòng)度的近期改善作用。方法選擇失代償期肝硬化患者65例，隨機(jī)分為骨髓組33例和臍血組32例；骨髓組患者經(jīng)股動(dòng)脈插管至肝固有動(dòng)脈注入自體骨髓干細(xì)胞移植治療，臍血組經(jīng)同樣途徑注入臍帶血干細(xì)胞治療；治療后8周檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、凝血酶原活動(dòng)度、白蛋白和甲胎蛋白水平變化，同時(shí)觀察臨床癥狀的改善情況及術(shù)后的不良反應(yīng)。結(jié)果治療后第3天兩組患者乏力、納差癥狀均有改善，兩組間差異無顯著性。治療后8w，骨髓組和臍血組白蛋白水平分別由（31.0±4.6）g/L上升至（34.6±7.1）g/L和由（34.6±7.1）g/L上升至（37.8±8.3）g/L，凝血酶原活動(dòng)度上升由（48.8±13.4）%上升至（55.5±11.2）%和由（47.5±12.5）上升至（58.9±14.0）%，但兩組間改善程度的差異無顯著性；在治療8w末血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素和甲胎蛋白在骨髓組分別為（45.6±12.3）IU/L、（28.1±13.5）μmol/L和（11.3±4.1）μg/L，在臍血組分別為（47.2±11.8）IU/L、（30.7± 14.8）μmol/L和（9.8±3.5）μg/L，兩組間與基礎(chǔ)水平相比改善程度的差異也無顯著性。結(jié)論自體骨髓干細(xì)胞或臍帶血干細(xì)胞經(jīng)肝動(dòng)脈途徑移植治療失代償期肝硬化患者的近期療效及安全性均良好，但兩種細(xì)胞治療的改善水平無顯著差異。

肝硬化；自體骨髓干細(xì)胞；臍帶血干細(xì)胞；細(xì)胞移植；療效

目前，干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用越來越令人矚目，也為失代償期肝硬化患者的治療提供了新的方法。已有的干細(xì)胞治療的報(bào)道多采用自體骨髓干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、外周造血干細(xì)胞等，在臨床上取得了一定的效果[1～10]。有研究報(bào)道臍血內(nèi)干細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量較骨髓內(nèi)更為優(yōu)越，更具有自我更新、增殖分化和體外擴(kuò)增的潛能[11～20]。本文比較了自體骨髓干細(xì)胞和臍帶血干細(xì)胞經(jīng)肝動(dòng)脈注入肝內(nèi)治療失代償期肝硬化患者的近期療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇2006年12月至2012年5月在我科住院的失代償期乙型肝炎肝硬化患者65例，男42例，女23例；年齡34～60歲，平均年齡（42.2±4.5）歲。

診斷均符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南》。肝功能分級(jí)屬于Child-Pugh B/C級(jí)。無感染和原發(fā)性肝癌等并發(fā)癥。將患者隨機(jī)分為自體骨髓干細(xì)胞治療組33例和臍帶血干細(xì)胞治療組32例。兩組患者基線指標(biāo)無顯著性差異。

1.2 基礎(chǔ)治療兩組在治療前或在治療的同時(shí)已經(jīng)開始接受核苷類藥物抗病毒治療。給予兩組患者谷胱甘肽（古拉定，意大利斯德大藥廠）1.2g，加入5%葡萄糖注射液100ml中靜脈滴注，1次/d，門冬氨酸鉀鎂注射液30ml、維生素C 3.0，加入10%葡萄糖注射液250ml中靜脈滴注，1次/d。

1.3 術(shù)前準(zhǔn)備及干細(xì)胞分離與治療患者在術(shù)前

簽署自體骨髓干細(xì)胞或臍帶血干細(xì)胞治療知情同意書，做好心理護(hù)理，減輕患者的緊張和恐懼心理。雙側(cè)腹股溝備皮，行碘過敏試驗(yàn)。在無菌條件下，選擇兩側(cè)髂后上棘為穿刺點(diǎn)，消毒、局部麻醉，以18號(hào)骨髓穿刺針穿刺，抽取骨髓血160～190 ml，肝素抗凝。在婦產(chǎn)科醫(yī)生的協(xié)助下選擇HBsAg、抗HCV、抗HIV和抗梅毒螺旋體抗體陰性的健康產(chǎn)婦，在孕婦分娩后馬上取其臍帶血60～100 ml，配血型，與患者血型相同。應(yīng)用寧夏中聯(lián)達(dá)生物有限公司生產(chǎn)的細(xì)胞分離試劑盒分離干細(xì)胞，將臍帶血轉(zhuǎn)移至A液瓶?jī)?nèi)，加入B液，充分混勻，室內(nèi)靜置約20～30 min，觀察到A液瓶?jī)?nèi)有明顯的紅細(xì)胞沉降層后，將上清液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，2500 r/m離心5 min，棄去上清液，每管加注生理鹽水，最后收集在一個(gè)50 ml離心管中。取2支新的50 ml離心管，各加入25 ml C液，將收集到的細(xì)胞懸液加入到含有25 ml C液的離心管中，1800 r/m離心30 min。仔細(xì)地吸取中間云霧狀細(xì)胞層。加生理鹽水至50 ml，2500 r/m離心5 min，棄去上清液，加入生理鹽水，混勻，1800 r/m離心5 min，如此共洗滌3次，最后棄去上清液，適量稀釋存在于離心管最底部的細(xì)胞，保存于5 ml試管中。取100 μl細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。本組分離的臍帶血干細(xì)胞數(shù)目在1～5×107之間。在放射介入條件下，經(jīng)股動(dòng)脈插管至肝固有動(dòng)脈，將分離好的細(xì)胞懸液注入肝內(nèi)，穿刺點(diǎn)處加壓包扎，術(shù)后術(shù)側(cè)下肢制動(dòng)8h，3d內(nèi)避免過度運(yùn)動(dòng)。預(yù)防性應(yīng)用頭孢唑林2g/12h，靜脈滴注，連用3d。

1.4 臨床檢測(cè)采用速率法檢測(cè)肝功能（廣州標(biāo)佳公司）；采用雅培公司提供的原裝試劑檢測(cè)凝血功能指標(biāo)；采用放射免疫法檢測(cè)AFP（北京北方生物試劑研究所）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，組間比較用成對(duì)資料的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 患者自覺癥狀改善情況在治療后第3天，兩組全部患者乏力、納差癥狀有改善，兩組間差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2 肝功能和PTA改善情況如表1所示，在治療后8w，骨髓細(xì)胞和臍血細(xì)胞移植患者肝功能指標(biāo)無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 不同Child-Pugh分級(jí)患者治療前后肝功能指標(biāo)的變化情況見表2和表3。

2.4 不良反應(yīng)兩組均未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)及并發(fā)癥。

表1 兩組患者肝功能和AFP（）的比較

表1 兩組患者肝功能和AFP（）的比較

與骨髓干細(xì)胞移植組比，①P＞0.05

例數(shù)ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）AFP（μg/L）骨髓33治療前27.5±6.348.8±13.450.4±11.130.6±14.710.±4.7治療后34.6±7.155.5±11.245.6±12.328.1±13.511.3±4.1臍血32治療前26.6±8.047.5±12.552.5±10.734.4±15.28.2±3.9治療后37.8±8.3①58.9±14.0①47.2±11.8①30.7±14.8①9.8±3.5①

表2 兩組Child-Pugh B級(jí)患者肝功能指標(biāo)（）的比較

表2 兩組Child-Pugh B級(jí)患者肝功能指標(biāo)（）的比較

與骨髓干細(xì)胞移植組比，①P＞0.05

例數(shù)ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）骨髓23治療前31.0±4.660.2±7.649.0±11.324.9±13.1 8 w后37.6±6.966.0±7.440.8±13.020.8±12.9臍血24治療前8 w后30.8±4.4 39.3±7.6①61.1±7.9 67.3±8.2①50.0±12.8 43.7±12.5①23.0±12.8 21.3±13.7①

表3 兩組Child-Pugh C級(jí)患者肝?功能指標(biāo)（）的比較

表3 兩組Child-Pugh C級(jí)患者肝?功能指標(biāo)（）的比較

與骨髓干細(xì)胞移植組比，①P＞0.05

例數(shù)ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）骨髓10治療前24.6±4.850.5±7.454.6±14.339.1±11.0 8 w后29.5±7.151.9±7.452.3±14.033.0±14.1臍血8治療前8 w后23.2±4.4 33.2±6.4①51.9±6.0 54.0±8.0①53.9±14.1 51.8±15.1①42.0±12.4 32.3±14.1①

3 討論

失代償期肝硬化是慢性肝病的終末期狀態(tài)，在我國(guó)發(fā)病率高，危害嚴(yán)重，目前臨床上缺乏特異的治療方法。如何改善終末期肝病患者的肝功能成為臨床治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來，隨著干細(xì)胞技術(shù)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療為失代償期肝硬化患者提供了新的治療方法。干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，在一定的條件下可以分化為各種功能細(xì)胞，發(fā)揮修復(fù)組織器官的作用。

目前，有關(guān)干細(xì)胞治療失代償期肝硬化患者的報(bào)道較多，且取得了較好的療效。已有的報(bào)道多采用自體骨髓干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞等[1～10]。與骨髓和外周血干細(xì)胞相比，臍帶血干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖分化能力，其免疫原性弱，移植物抗宿主病發(fā)生率低，無腫瘤細(xì)胞污染，從配型到獲得細(xì)胞時(shí)間短，成本低廉，而且臍血在基礎(chǔ)科研及臨床運(yùn)用中較少涉及社會(huì)倫理和法律問題[11]。由于這些優(yōu)點(diǎn)，使臍血在移植研究中作為一種特別的細(xì)胞資源，備受關(guān)注。

據(jù)報(bào)道臍帶血所含干細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上明顯優(yōu)于骨髓血所含干細(xì)胞。目前發(fā)現(xiàn)臍帶血中的干細(xì)胞有造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞[12～14]。大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)臍帶血造血干細(xì)胞比骨髓和動(dòng)員的外周血來源的造血干細(xì)胞更原始、更具有自我更新、增殖分化和體外擴(kuò)增潛能。周漢超等[15]報(bào)道分離后的臍血干細(xì)胞的CD34和CD38數(shù)量明顯多于骨髓血干細(xì)胞。據(jù)報(bào)道臍帶血中的CD34+細(xì)胞所占比例與骨髓相似，但在質(zhì)量上，在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的臍血CD34+細(xì)胞中CD34+CD45+細(xì)胞明顯高于骨髓，CD34+CD38-和CD34+CD33-細(xì)胞在臍血中的比例均高于骨髓，而且臍血CD34+CD38-細(xì)胞的增殖分化能力高于骨髓[17，18]。存在于臍血中CD34+CD38-細(xì)胞群可以再動(dòng)員SCID小鼠的免疫細(xì)胞，使之部分恢復(fù)細(xì)胞免疫功能[19]。此外，臍帶血中造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量及增殖能力也均高于骨髓[20]。這些原因可能就是為什么使用少量的臍帶血來分離干細(xì)胞要比抽取大量的骨髓分離細(xì)胞來的經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。

有報(bào)道臍血干細(xì)胞治療后患者臨床癥狀和體征改善明顯高于骨髓干細(xì)胞治療后[15]，但也有報(bào)道顯示兩組患者治療效果相似，無顯著性差異[16]。本研究使用臍帶血和骨髓血干細(xì)胞治療患者65例，比較兩組發(fā)現(xiàn)在療效方面無顯著性差異，兩組在臨床上均取得了較好的療效，在臨床癥狀改善方面兩組間相似，臍血組在生化指標(biāo)改善方面優(yōu)于骨髓組，除了AST在臍血組的下降較骨髓組有顯著性差異外，余項(xiàng)指標(biāo)臍血組均優(yōu)于骨髓組，但兩組間無顯著性差異。不同的研究者報(bào)道的療效間有所差異，可能與選取的患者特征、抽取的骨髓量、臍血量、細(xì)胞分離的方法、所得細(xì)胞數(shù)量和觀察時(shí)間點(diǎn)等因素不同有關(guān)?？傮w來講，臍血干細(xì)胞治療的療效較骨髓干細(xì)胞治療有優(yōu)勢(shì)，這與上述基礎(chǔ)研究的結(jié)果是一致的。因骨髓穿刺有創(chuàng)傷，且年齡大的肝病患者骨髓質(zhì)量較差，所以對(duì)于年齡大于40歲以上的患者行臍帶血干細(xì)胞治療可能會(huì)更獲益。

本研究顯示，臍帶血和骨髓血干細(xì)胞治療后患者血清白蛋白水平和凝血酶原時(shí)間均有明顯的改善，說明注入肝臟的干細(xì)胞發(fā)揮了修復(fù)病損肝臟的功能，使肝臟的合成功能有了不同程度的改善。干細(xì)胞在肝臟內(nèi)如何發(fā)揮作用，其具體的機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能的機(jī)制是干細(xì)胞進(jìn)入肝臟后在肝臟的微環(huán)境中分化為實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞，或是進(jìn)入肝臟的干細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子而促進(jìn)肝細(xì)胞的再生。干細(xì)胞能夠產(chǎn)生重要的細(xì)胞-細(xì)胞接觸和支持造血的生長(zhǎng)因子，還能通過誘導(dǎo)“歸巢”受體將干細(xì)胞融合入肝臟，進(jìn)而使干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝樣細(xì)胞而發(fā)揮作用，這是需要進(jìn)一步研究和探討的問題。

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（收稿：2013-12-30）

（校對(duì)：陳從新）

Safetyandshort-termefficacyofautologousbonemarroworumbilicalcordbloodstemcells

transplantation through hepatic artery in treatment of patients with decompensated cirrhosis

Wang Fang,

Yun Shenghao，Zhou Xinren，et al.Department of Infectious Diseases，Anning Branch of General Hospital,Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730070，Gansu Province，China

ObjectiveTo investigate the safety of autologous bone marrow stem cells or umbilical cord blood stem cells transplantation in treatment of patients with decompensated cirrhosis through hepatic artery and the improvement in liver function and prothrombin activity in a short term.MethodsSixty-five patients with decompensated cirrhosis were randomly divided into bone marrow group（33 cases）and umbilicus cord blood group（32 cases）；patients in bone marrow group received autologous bone marrow stem cells transplantation through hepatic artery and the umbilicus cord blood group received umbilical cord blood stem cells through the same way；thechangesofserumalanineaminotransferase，totalbilirubin，prothrombinactivity，albuminandalphafetoprotein after 8 weeks were determined，and the improvement in symptoms and postoperative adverse reactions wereobserved.ResultsThreedaysaftercelltransplantation，patientsinbothgroupsachievedsignificantly improvement in symptom such as fatigue and anorexia but had no significantly difference between the two groups. At eight weeks post therapy，in patients of bone marrow group and umbilicus group，serum albumin level increased significantly from the baseline of（31.0±4.6）g/L to（34.6±7.1）g/L and（26.6±8.0）g/L to（37.8±8.3）g/L，prothrombin activity from（48.8±13.4）%to（55.5±11.2）%and（47.5±12.5）to（58.9±14.0）%，but the improvement did not differ between the two groups；alanine aminotransferase，total bilirubin and alpha-fetoprotein were（45.6±12.3）IU/L，（28.1±13.5）μmol/L and（11.3±4.1）μg/L respectively in patients of bone marrow group and（47.2±11.8）IU/L，（30.7±14.8）μmol/Land（9.8±35）μg/Lrespectivelyinpatientsof umbilicalgroupat8weeksposttherapy，butthe improvement did not differ between groups.ConclusionsIt issafeandeffectiveintreatmentofpatientswithdecompensated cirrhosis using autologous bone marrow stem cells and umbilical cord blood stem cells transplantation through hepatic artery and no significant difference was observed between the two group.

Cirrhosis；Autologousbonemarrowstemcells；Umbilicalcordbloodstemcells；Cell transplantation；Efficacy

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.04.006

甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：0708NKCA093）

730070蘭州市蘭州軍區(qū)總醫(yī)院安寧分院感染病科（王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡國(guó)芳，陳瑞麗，楊興坤，張靜）；婦產(chǎn)科（馮淑嫻）

王方，女，44歲，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師。主要研究方向?yàn)槁愿尾〉陌l(fā)病機(jī)理和治療學(xué)研究。E-mail：kaixin919@163.com