缺氧/復氧對體外培養(yǎng)星形膠質細胞腦源性神經營養(yǎng)因子合成及釋放的影響

肖 君，張 函，王 偉，謝敏杰，喻志源，何 丹

急性缺血性卒中是嚴重危害人類身心健康和生活質量的主要疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、低治愈率的特點［1］。因此，闡明缺血性卒中的復雜病理生理過程一直是神經科學領域研究的熱點。星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)數量最多的細胞，神經損傷后，星形膠質細胞活化，可能與神經損傷后神經營養(yǎng)因子表達量的增高有關［2］。腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經營養(yǎng)因子家族(neurotrophic factors，NTFs)的一員［2，3］，可通過調控神經元的存活和生長、影響突觸可塑性［4］等途徑，在腦卒中的康復過程中對神經元的存活、生長及功能維持起重要的作用［5］。本實驗通過建立體外培養(yǎng)星形膠質細胞缺氧/復氧模型、檢測缺氧/復氧條件下星形膠質細胞活力變化、并觀察缺氧/復氧對星形膠質細胞BDNF合成及釋放的影響，從而明確腦缺血與星形膠質細胞分泌功能之間的關系。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 實驗動物:新生SD 乳鼠，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號:SCXK(鄂)2008-0005。主要試劑:DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Hyclone 公司)，DAPI 及多聚賴氨酸(美國sigma 公司)，多克隆GFAP 抗體(美國Neomarkers 公司)，BDNF ELISA 試劑盒(美國Promega 公司)，兔抗BDNF 多克隆抗體及羊抗兔HRP 二抗(英國Abcam 公司)，GADPH 兔抗單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology 公司)。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠大腦皮質星形膠質細胞原代培養(yǎng) 無菌條件下取新生(3 d 內)SD 大鼠大腦，DMEM/F12 漂洗3 次，剔除軟腦膜，取大腦皮質，眼科剪剪碎，巴氏管吹打為細胞懸液，經直徑200 目篩網過濾，800 rpm 離心8 min，棄上清，全培養(yǎng)基(DMEM/F12+20%胎牛血清)重懸，接種于多聚賴氨酸(0.1 mg/ml)包被的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);2～3 d 換一次液。細胞生長至融合時按1∶2～3 傳代至新培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。實驗所用細胞為傳2 代細胞。

1.2.2 實驗分組及缺氧/復氧模型的建立 本實驗分為兩組:正常組(N)及缺氧/復氧組(H/R)。采用缺氧孵箱法，將含5%CO2的正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)達80%融合的星形膠質細胞置于94% N2、1%O2及5% CO2的缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)環(huán)境中，缺氧不同時間點(3 h、6 h、12 h、24 h)，再置于含5%CO2的正常培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)相應復氧時間(0 h、12 h、24 h、48 h、72 h)，建立星形膠質細胞缺氧/復氧模型。

1.2.3 缺氧/復氧對細胞活力的影響 通過MTT 法檢測缺氧/復氧對細胞活力的影響，具體方法如下:將處于對數生長期的細胞經0.25%胰蛋白酶消化后調整細胞濃度至10×103/ml，接種至96 孔培養(yǎng)板，每孔160 μl;全培養(yǎng)基(DMEM/F12 培養(yǎng)液+20%胎牛血清)培養(yǎng)18 h～24 h，待細胞貼壁生長良好后開始MTT 檢測;實驗分3 組:N 組、H/R 組及空白調零組，每組10 孔，其中不接種細胞的作為空白調零組。分別在復氧后不同時間點，每孔加入40 μl MTT 液，37 ℃、95% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h;吸走MTT 液，每孔加入150 μl DMSO 顯色;輕微震蕩后以空白調零組調零，酶標儀(460 nm 波長)測定各孔的吸光度值(OD 值)。

1.2.4 ELISA 檢測BDNF 的分泌及合成 星形膠質細胞培養(yǎng)液離心10 min，取上清后，向孔板中加入RIPA 裂解液，冰上裂解15 min 后，離心取細胞裂解液，均置于-80 ℃冰箱保存。根據試劑盒的檢測方法分別測量不同時間點上清及細胞裂解液中所含的BDNF。

1.2.5 Western blot 檢測BNDF 的合成 將處于對數生長期的細胞經0.25%胰蛋白酶消化后按3×105/ml 的密度接種至10 cm 細胞培養(yǎng)皿;全培養(yǎng)基(DMEM/F12 培養(yǎng)液+20%胎牛血清)培養(yǎng)12～18 h，待細胞貼壁生長良好后開始實驗;復氧后不同時間點提蛋白。BCA 法進行蛋白定量。將等量的蛋白標本加入SDS-PAGE 凝膠的加樣孔，電泳90 min;然后電轉至NC 膜;封閉液封閉2 h 后，加入兔抗BDNF 多克隆抗體(濃度)，4 ℃孵育過夜;TBST 漂洗3 遍后，加入1∶5000 的羊抗兔HRP 二抗，孵育2 h;用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃膜，Quantity One 4.62 進行定量分析，并以GADPH 為內參進行校正。

2 結果

2.1 缺氧/復氧對體外培養(yǎng)星形膠質細胞活力的影響 通過倒置顯微鏡，在缺氧不同時間點進行觀察，隨著缺氧時間的延長，星形膠質細胞胞體逐漸皺縮，培養(yǎng)皿內的漂浮細胞和細胞碎片逐漸增多。缺氧6 h 以內，星形膠質細胞形態(tài)與對照組無明顯差異;而缺氧12 h 后，視野中見星形膠質細胞出現大量空泡，細胞破碎甚至死亡。為了排除細胞死亡對后續(xù)實驗的影響，選擇缺氧6 h 作為后續(xù)實驗的干預時間。接著我們用MTT 法檢測缺氧/復氧對星形膠質細胞細胞活力的影響。缺氧6 h 后復氧不同時間點的MTT OD 值與正常組相比無顯著性差異(P＞0.05)，說明單純缺氧復氧72 h 以內不會對體外培養(yǎng)星形膠質細胞的細胞活力產生明顯影響(見表1)。

2.2 缺氧/復氧對體外培養(yǎng)星形膠質細胞BDNF釋放的影響 我們檢測了缺氧/復氧不同時間點體外培養(yǎng)星形膠質細胞BDNF 的分泌。結果表明，與正常對照組相比，缺氧/復氧組星形膠質細胞條件性培養(yǎng)液中的BDNF 含量雖然有所增加，但沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，提示單純缺氧/復氧情況下還不足以引起體外培養(yǎng)星形膠質細胞BDNF 分泌的顯著變化。

2.3 缺氧/復氧對體外培養(yǎng)星形膠質細胞BDNF 合成的影響 缺氧6 h 復氧0 h、12 h、24 h 時，星形膠質細胞細胞裂解液中的BDNF 的含量較之正常培養(yǎng)組無明顯增高(P＞0.05)，而在復氧48 h、72 h時，其BDNF 的含量分別是正常組的1.34 倍和1.46倍，均有顯著增高(P＜0.01)。因此我們運用Western blot 檢測了缺氧/復氧48 h 及72 h 的BDNF 的蛋白含量，在復氧48 h、72 h 時，星形膠質細胞BDNF 蛋白的合成有顯著增加(P＜0.01)，與ELISA 檢測結果一致。

表1 缺氧/復氧不同時間點星形膠質細胞MTT OD 值的影響(±s，n=10)

表1 缺氧/復氧不同時間點星形膠質細胞MTT OD 值的影響(±s，n=10)

3 討論

在中樞神經系統(tǒng)中，星形膠質細胞是含量最為豐富的膠質細胞類型，對維持大腦功能的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用［6］。經過數年的研究，已經證實了星形膠質細胞不僅對神經元起支持作用，而且還通過合成多種神經營養(yǎng)因子對中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、神經遞質的攝取、離子穩(wěn)態(tài)及血腦屏障的維持等起到了支持和保護的作用［7］。BDNF 為神經營養(yǎng)因子家族的一員，調控神經元的存活和生長，影響突觸可塑性，能夠減少神經損傷的發(fā)生。因此在本實驗中，通過研究星形膠質細胞在缺氧/復氧損傷時星形膠質細胞活化的變化以及對BDNF 合成和釋放的影響，對腦缺血后神經功能保護的機制探討具有重要的意義。

既往研究表明，多種病理情況下，如腦缺血缺氧、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、帕金森氏病以及阿爾茨海默病等，BDNF 對神經元的存活起保護作用［2，8，9］。由此我們推測，腦缺氧時星形膠質細胞BDNF 表達量增加，BDNF 通過調控神經元的存活和生長，從而減少神經損傷的發(fā)生。

為了驗證上述假說，我們研究了缺氧/復氧條件下體外培養(yǎng)星形膠質細胞活力變化及腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)釋放和表達的變化。我們首先運用MTT 法檢測了缺氧/復氧條件下星形膠質細胞活力的變化，發(fā)現單純缺氧6 h/復氧72 h 以內，星形膠質細胞的活力并無明顯變化，提示本實驗條件下的缺氧/復氧不會引起星形膠質細胞的死亡。在此基礎上，我們分別通過ELISA 和Western blot 檢測了缺氧/復氧不同時間點大鼠皮質星形膠質細胞BDNF的合成和釋放量的變化，結果發(fā)現BDNF 的釋放量無明顯差異，但是其合成量在復氧48 h 之后較對照組增加。既往研究對此報道不一。Qu［10］等人研究報道，在短暫前額葉缺血時，BDNF 及其受體水平均上調，筆者認為這是一個自我保護的自適應機制，對損傷細胞的存活生長有重要意義。而另有研究又發(fā)現包括BDNF 在內的神經營養(yǎng)因子在缺血腦組織(糖氧剝奪1 h、再灌注24 h 后)中的表達量是下調的［11］。結果不盡相同，原因是由于實驗條件、缺氧模型的差異、缺氧及再灌注的時間以及樣本采集時間的不同所導致。

綜上所述，我們的研究結果提示，單純缺氧/復氧不足以引起體外培養(yǎng)星形膠質細胞BNDF 的釋放改變以及細胞的活力變化，但是可影響B(tài)DNF 合成的增加，提示BDNF 在腦缺血缺氧情況下可能間接發(fā)揮了一定的腦保護作用，其機制有待進一步研究。

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