提高成纖維細胞生長因子-21產率和純度

于丹，葉賢龍，任桂萍，徐鵬飛，厲書杰，牛澤杉，李德山

東北農業(yè)大學生命科學學院 生物制藥教研室，黑龍江 哈爾濱 150030

成纖維細胞生長因子-21(FGF-21)是成纖維細胞因子家族的新成員[1]，具有不依賴胰島素調節(jié)糖脂代謝[2]，改善胰島素抵抗，提高靶組織對胰島素敏感性等多種代謝調控功能，不會導致低血糖、水腫、過敏等毒副作用[3]。FGF-21在糖尿病臨床應用方面具有很大的潛力，給糖尿病患者帶來新希望[4]。

大腸桿菌以包涵體形式表達外源蛋白，具有表達量及純度高的突出優(yōu)點，而可溶形式表達目的蛋白不僅產量低，而且上清中含有大量宿主細胞染色體翻譯表達的雜質蛋白，純化工藝復雜[5-6]。目前，科研人員卻仍以大腸桿菌表達可溶形式FGF-21，這是因為FGF-21蛋白本身結構與性質使其表達量及復性率降低[1-7]，復性后蛋白活性減弱甚至喪失。科研人員曾用多種表達載體及優(yōu)化各種方法以包涵體形式表達FGF-21，但均未能解決上述問題。

本實驗采用SUMO表達載體首次以包涵體形式表達hFGF-21，突破了傳統包涵體離心洗滌，人工變復性的復雜生產工藝，將中空纖維柱膜過濾技術應用于包涵體形式蛋白的整個生產過程中。最終，90%以上SUMO-hFGF-21形成包涵體，其表達量約為可溶性表達的3倍；由于復性條件溫和及作為分子伴侶的SUMO標簽促進了蛋白質的正確折疊[8]，使hFGF-21復性率顯著提高，獲得的ihFGF-21生物學活性較shFGF-21無顯著差異，為hFGF-21由實驗室向中試及產業(yè)化生產提供了更經濟、更高效的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工程菌

攜帶pSUMO-hFGF-21質粒的工程菌由東北農業(yè)大學生物制藥教研室提供。

1.1.2 試劑

異丙基硫代β-D-半乳糖苷 (IPTG)、溶菌酶、氨芐青霉素 (Amp)購自TaKaRa公司。葡萄糖檢測試劑盒購自北京金豪制藥股份有限公司。Quixstand膜處理系統，750 kDa和10 kDa中空纖維柱，AKTATMpurifier100系統，Ni Sepharose 6 FF及HiPrep 26/10 Desalting均購自GE公司。

1.1.3 實驗細胞及動物

HepG2細胞為東北農業(yè)大學生物制藥教研室提供。db/db小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物質量合格證號SCXK(滬)2013-0002。

1.2 方法

1.2.1 人成纖維細胞生長因子-21融合蛋白(iSUMO-hFGF-21)的包涵體表達

取保存于–80℃的攜帶pSUMO-hFGF-21質粒的工程菌，在含有氨芐青霉素 (100 U/mL)的TB固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)過夜;挑取單菌落，接種于20 mL TB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h后，以1∶100的比例接種于500mL含氨芐青霉素(100 U/mL)TB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約3.5 h，A600=0.6–0.8時，加入IPTG至終濃度為 0.25mmol/L，37℃誘導4 h后，4 000 r/min離心30 min收集菌體，15%SDS-PAGE鑒定表達量。

1.2.2 iSUMO-hFGF-21包涵體的提取、洗滌、變性及復性

將收集的菌體按1 g/10 mL的比例懸浮于平衡緩沖液 (40 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)中，加入終濃度為1 mg/mL的溶菌酶，冰上放置1 h，超聲波破碎菌體細胞 (工作 1 s，間隔 1 s，4 min/次，共 3 次)。

用750 kDa中空纖維柱超濾膜富集包涵體，棄去滲透端流出液體。當總體積約為50 mL時，加入 200 mL洗滌液 (20 mmol/L Na3PO4，2 mol/L尿素，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)洗滌包涵體，當溶液體積為50 mL，再向其中加入洗滌液至200 mL。重復上述實驗4次。

在750 kDa的中空纖維柱超濾膜中，關閉滲透端，向洗滌后的包涵體中加入200 mL的變性液 (20 mmol/L Na3PO4，8 mol/L Urea，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)，循環(huán)變性2 h。完全變性后，打開滲透端，滲透端收集液即為iSUMO-hFGF-21變性液。用10 kDa中空纖維柱對變性后的iSUMO-hFGF-21進行復性：將盛有復性液的三角瓶 (20 mmol/L Na3PO4，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)用膠皮管與中空纖維柱的儲液器連接。向儲液器中加入變性液后，打開透過端，由于儲存器中產生負壓，使復性液以一定的速度滴加至變性液中，緩慢復性。當加入復性液總體積為變性液體積20倍時，8 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清，即完成iSUMO-hFGF-21的復性。

1.2.3 ihFGF-21的純化

用平衡緩沖液(40 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)平衡 Ni Sepharose 6 FF親和層析柱5個柱體積后，上樣。再用平衡緩沖液洗去非特異性吸附的雜質蛋白，洗脫液 (500 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)洗脫融合蛋白iSUMO-hFGF-21，收集洗脫峰。經Sephadex G-25脫鹽柱將iSUMO-hFGF-21置換到磷酸鹽緩沖溶液 (50 mmol/L Na3PO4，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)中，加入SUMO 蛋白酶I至終濃度為2 mmol/L，4℃酶切過夜[9]。再經Ni Sepharose 6 FF親和層析，收集流穿液，15%SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白ihFGF-21的產量及純度。

1.2.4 shFGF-21的表達與純化

將攜帶重組質粒 pSUMO-hFGF-21的工程菌，劃線培養(yǎng)；單菌落接種至20 mL含氨芐青霉素 (100 U/mL)LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h，按1%的比例接種于500 mL/瓶含氨芐青霉素(100 U/mL)LB培養(yǎng)基三角瓶中，37℃培養(yǎng)2.5 h，A600=0.3–0.4時，加入IPTG至濃度為0.25 mmol/L進行誘導，4 h后4 000 r/min、4℃離心30 min，以1 g/10 mL的比例重懸菌體，放置–20℃保存；待收集上述菌體20 L后，超聲波破碎；破碎完全后4 000 r/min、4℃離心30 min。shFGF-21純化策略，產量和純度檢驗方法與上述ihFGF-21相同。

1.2.5 免疫印跡法檢測ihFGF-21

以shFGF-21作為陽性對照，BSA作為陰性對照，將純化的產物進行15%SDS-PAGE電泳然后轉至硝酸纖維素膜上。轉膜完成后，經5%脫脂奶粉-PBS-0.05%Tween 20室溫封閉2 h，與兔抗人FGF-21單抗反應12 h，PBS洗滌5次，每次5 min。再與HRP偶聯的羊抗兔二抗室溫反應2 h，洗滌后加入發(fā)光底物DAB避光顯影。

1.2.6 ihFGF-21與shFGF-21細胞水平上生物學活性的比較

利用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)[10]檢測hFGF-21促進細胞糖吸收的生物學作用。HepG2細胞饑餓12 h后，分別用10、100及 1 000 nmol/L的ihmFGF21蛋白和shFGF21蛋白刺激細胞 24 h；在24 h時，分別取培養(yǎng)上清液2 μL，加入到200 μL葡萄糖檢測液中，37℃反應5–10 min，在490 nm波長下檢測其OD值。每孔重復3次，按公式計算細胞對葡萄糖的消耗率并運用SPSS軟件分析實驗結果，兩組間數據比較采用t檢驗。

計算培養(yǎng)液中殘留的葡萄糖的濃度，公式為：

葡萄糖濃度 (mmol/L)=OD樣品/OD標準×5.55 mmol/L。

計算細胞對葡萄糖的消耗率，公式為：

細胞葡萄糖消耗率 (%)=[(C空白葡萄糖–C給藥葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100%。

1.2.7 ihFGF-21與shFGF-21調節(jié)2型糖尿病模型db/db鼠短期與長期生物學活性的比較

將成模的db/db小鼠隨機分為 3組，每組5只。通過皮下注射的方式，給予各實驗組相應的蛋白1次，劑量0.5 mg/kg，模型對照組注射相同體積的生理鹽水，給藥3 h后，尾靜脈取血檢測血糖濃度，比較兩種蛋白調節(jié)模型小鼠血糖的短期降糖效果。每天早上8點給藥，連續(xù)注射16 d，每兩天檢測各處理組小鼠的血糖1次，停藥后繼續(xù)觀察小鼠血糖3 d，觀察兩種蛋白的長期降糖活性的差異。

2 結果與分析

2.1 iSUMO-hFGF-21與sSUMO-hFGF-21的表達量分析

取3 mL菌液，離心、破碎完全后，15%SDS-PAGE電泳比較iSUMO-hFGF-21與sSUMO-hFGF-21的表達量，根據凝膠成像灰度分析軟件分析表明，iSUMO-hFGF-21的表達量約是sSUMO-hFGF-21的3倍，結果如圖1所示。

2.2 iSUMO-hFGF-21包涵體的提取、洗滌、變性及復性

菌體破碎完全后，應用中空纖維柱對包涵體進行洗滌，除去部分雜質蛋白、脂質、核酸等。重復洗滌3次后，溶解包涵體，當溶液呈棕黃色、透明狀態(tài)時，打開滲透端，收集滲透端流出液即為完全變性的iSUMO-hFGF-21。用10 kDa中空纖維柱對融合蛋白iSUMO-hFGF-21進行復性后，8 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清。經SDS-PAGE分析可知，洗滌及復性過程中iSUMO-hFGF-21幾乎無損失，且洗滌后iSUMO-hFGF-21包涵體的純度為73%，說明應用中空纖維柱膜過濾技術，不僅提高了蛋白的收率，而且提高目的蛋白的純度，結果如圖2所示。

2.3 ihFGF-21的純化

圖2 SDS-PAGE分析iSUMO-hFGF-21的純度Fig.2 Purity analysis of the iSUMO-hFGF-21 protein by SDS-PAGE.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:iSUMO-hFGF-21 before washing(20 μL);2：iSUMO-hFGF-21before washing(10 μL);3:iSUMO-hFGF-21 afterwashing;4:supernatantof iSUMO-hFGF-21 after denaturing;5:supernatant of iSUMO-hFGF-21 after refolding.

圖3 iSUMO-hFGF-21親和層析純化結果Fig. 3 Affinity chromatography result of iSUMO-hFGF-21.

結果顯示，經過Ni Sepharose FF親和層析(圖3)，Sephadex G-25脫鹽，酶切以及再次應用親和層析 (圖4)后，收集流穿液即為成熟的ihFGF-21，15%SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白hFGF-21的濃度及純度。根據凝膠成像分析軟件灰度分析表明，ihFGF-21的純度約為95%以上，最終收率約為20 mg/L(圖5)。

2.4 shFGF-21的表達與純化

結果顯示，經過Ni Sepharose FF親和層析(圖6)，Sephadex G-25脫鹽，酶切以及再次親和層析后，收集流穿液即為成熟的ihFGF-21，15%SDS-PAGE電泳檢測hFGF-21的濃度及純度。根據凝膠成像分析軟件灰度分析表明，shFGF-21純度為90%，總的表達量為6 mg/L(圖7)。

圖4 ihFGF-21親和層析純化結果Fig.4 Affinity chromatography result of ihFGF-21.

圖5 iSUMO-hFGF-21和ihFGF-21純化后蛋白表達量與純度分析Fig.5 Yield and purity analysis of the ihFGF-21 protein after purification.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:iSUMO-hFGF-21 protein;2,3:mature ihFGF-21 after enzyme digestion and purification.

2.5 ihFGF-21與shFGF-21免疫印跡比較理化性質的差異

圖7 SDS-PAGE分析純化后shFGF-21的收率及純度Fig.7 Yield and purity analysis of the shFGF-21 protein after purification.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:mature shFGF-21.

經Anti-ihFGF-21單抗的免疫印跡實驗(其中BSA為陰性對照，shFGF-21為陽性對照)，硝酸纖維素膜上，陰性對照BSA泳道為空白，陽性對照shFGF-21與實驗組ihFGF-21均出現單一條帶 (圖8)，證明純化的目的蛋白為成纖維細胞生長因子-21。

2.6 ihFGF-21與shFGF-21細胞水平上生物學活性的比較

結果如圖9所示，經過10、100、1000 nmol/L shFGF-21與ihFGF-21分別刺激后的細胞，采用GOD-POD法檢測其葡萄糖吸收率；實驗結果表明，與空白對照組相比，兩者均能顯著增加細胞葡萄糖吸收率，且呈劑量依賴性；不同濃度的shFGF-21與ihFGF-21促進細胞糖吸收的生物學活性無顯著差異 (P=0.563>0.05)，說明ihFGF-21與shFGF-21細胞水平上促進HepG2細胞糖吸收的生物學活性并沒有顯著差異，證明了采用中空纖維柱提取包涵體形式表達的FGF-21時，并沒有降低蛋白的生物學活性，此種提取工藝可行。

2.7 ihFGF-21與shFGF-21對db/db糖尿病模型鼠的短期降糖生物學活性的比較

注射前后，注射生理鹽水的模型對照組血糖沒有變化；注射3 h后，模型對照組的血糖由(16.02±4.29)mmol/L 升至(16.18±1.79)mmol/L，shFGF-21組血糖由(15.92±4.301)mmol/L降至(10.02±3.43)mmol/L，ihFGF-21 組 血 糖 由(16.15±3.67)mmol/L 降至(10.00±1.59)mmol/L。與模型對照組相比，無論作用效果還是作用時間，兩種途徑獲得的成熟蛋白都表現出了良好的降糖效果，血糖在注射1 h開始下降，注射3 h降糖效果較模型對照組相比差異極顯著，shFGF-21組與ihFGF-21組差異不顯著，結果如圖10所示。

2.8 ihFGF-21與shFGF-21對db/db糖尿病模型鼠的長期降糖生物學活性的比較

連續(xù)注射16 d后，檢測血糖。在長期調節(jié)2型糖尿病模型db/db鼠血糖的生物學功能上，與模型對照組相比，ihFGF-21與shFGF-21均表現出了顯著的差異，但兩者之間無顯著差異；兩者均能長期持續(xù)的調節(jié)2型糖尿病模型db/db鼠的血糖，停止注射3 d后，均恢復至與模型對照組相同的血糖水平 (圖11)。說明此法可以保證獲得的ihFGF-21的生物學活性，是提取hFGF-21的有效方法。

圖8 ihFGF-21與shFGF-21免疫印跡比較理化性質差異的分析Fig.8 Physical properties analysis of the difference between the ihFGF-21 and shFGF-21 proteins.1:mature ihFGF-21;2:mature shFGF-21;3:BSA;M:the relative molecular mass of standard proteins.

圖10 ihFGF-21與shFGF-2對db/db糖尿病模型鼠的短期降糖效果的比較Fig.10 Comparation of ihFGF-21and shFGF-21 on short-term hypoglycemic effect.The db/db mice were treated with 0.5 mg/kg shFGF-21 or ihFGF-21.The blood glucose level of the model mice were examined at 0 h and 3 h.The valuesshown are the average of 6 independent measurements.**P<0.01 vs control.

圖11 ihFGF-21與shFGF-21對db/db糖尿病模型鼠的長期降糖生物學活性的比較Fig.11 Comparation of ihFGF-21 and shFGF-21 on long-term hypoglycemic effect.The db/db mice were administrated once a day with saline (control),0.5 mg/kg shFGF-21 or ihFGF-21 for 16 d.The blood glucose level of db/db mice were examined before injection each day at 8 am.The valuesshown are the average of 6 independent measurements.

3 討論

近年來，隨著人們對成纖維細胞生長因子-21(FGF-21)結構和功能的深入研究， FGF-21安全、可靠，不依賴胰島素單獨調節(jié)糖脂代謝，改善胰島素抵抗，無副作用的報道，使其成為治療糖尿病、肥胖、脂肪肝等代謝疾病的潛力藥[11-12]。目前，FGF-21的生產已經逐漸由實驗室向中試規(guī)模轉變，開發(fā)高效、高純度的FGF-21的生產工藝，成為科研人員共同關注的焦點。

盡管大腸桿菌在表達外源基因方面有眾多的優(yōu)點，但是外源基因的高效表達[13]，除受到其本身性質影響外，還與表達系統的特性及其他因素密切相關。本研究通過優(yōu)化本實驗室構建的攜帶pSUMO-hFGF-21質粒工程菌的培養(yǎng)條件，采用TB培養(yǎng)基，150 r/min搖瓶培養(yǎng)，當菌體生長至A600=0.6–0.8時進行誘導，37℃誘導表達4 h，90%以上的SUMO-hFGF-21以包涵體形式表達，其表達量為可溶性表達表達量的3倍。這是由于采用包涵體形式表達FGF-21時，誘導溫度及轉速的升高提高了細胞內相關酶的活性，增加了溶氧；菌體濃度的增加，提高了蛋白的表達量；蛋白表達過快，無法快速正確折疊，從而形成包涵體[14]。包涵體形式表達FGF-21，提高了蛋白表達量，降低了生產成本，有利于規(guī)?；a。

如何對包涵體蛋白質進行體外高效復性是基因工程技術面臨的一個重要難題。傳統方法提取包涵體蛋白，不僅工藝復雜，生產周期長，而且復性率低，蛋白損失嚴重，復性后蛋白活性降低甚至無活性。而應用中空纖維柱膜過濾技術提取包涵體途徑純化表達的hFGF-21，顯著提高了蛋白的復性率。這可能是因為中空纖維柱復性過程中，將復性液緩慢加入變性液中，以緩慢的速度除去變性劑；變性劑除了能溶解包涵體使其去折疊外，在復性過程中還可以有效地抑制復性中間體相互聚集，從而增加復性率[15]。

本實驗從包涵體富集到復性，都采用中空纖維柱膜過濾技術，充分發(fā)揮了其處理量大、處理能力持久的優(yōu)勢。與傳統的離心方法相比，應用中空纖維柱對包涵體進行洗滌使生產周期縮短了1/3，且有效降低蛋白損失；大部分雜蛋白、脂類等雜質可透過膜孔，使包涵體洗滌更加徹底；循環(huán)變性2 h后，直接對變性液進行澄清，然后利用密閉儲藏器內產生的負壓緩慢加入復性液，緩慢進行稀釋復性，保證了溫和的復性條件，有利于提高FGF-21的正確折疊效率，最后通過離心獲得初級純化后的蛋白溶液。整個過程都在4℃展示柜中進行，低溫環(huán)境，有利于FGF-21的正確折疊[16]。經SDS-PAGE分析結果表明，iSUMO-hFGF-21的純度顯著高于sSUMO-hFGF-21，此法除去了多數非特異性吸附在層析介質上的雜質蛋白，簡化了純化工藝。

除此之外，本法獲得的成熟FGF-21的活性與可溶性表達獲得的FGF-21無顯著差別。通過免疫印跡法，證明所獲得的是hFGF-21。在細胞實驗中，兩者均可促進葡萄糖的吸收，且與空白對照組相比，差異顯著；在動物實驗中，兩種途徑獲得的FGF-21在短期藥效實驗中，均在注射1 h起作用，注射3 h血糖明顯降低；長期藥效實驗中，連續(xù)注射均可使模型動物的血糖降至正常水平，且降糖效果無明顯差異，說明以包涵體途徑可保證FGF-21的生物學活性。分析原因可能有以下兩點：第一，作為分子伴侶的SUMO標簽可以增強外源蛋白質抗蛋白酶水解，顯著增加重組蛋白表達量[17]，促進靶蛋白正確折疊，提高可溶性[18-19]等功能[20-23]；SUMO標簽的存在能使靶蛋白維持在具有折疊能力的狀態(tài)并使它們進行正確重折疊，同時能有效地保留靶蛋白質聚集體中天然結構；其機理可能是由于SUMO標簽作為一個高度疏水的核心為目的蛋白的折疊提供成核位點，減少了蛋白之間的相互作用，使其正確折疊，最終增加了融合蛋白的可溶性[24]；第二，采用中空纖維柱操作，條件溫和，有利于蛋白質的正確折疊，操作簡單，耗時短，避免了因長期暴露室溫導致蛋白活性下降。

中空纖維柱膜過濾技術，現已被廣泛用于菌體、細胞等的富集，菌液的澄清，緩沖液置換、蛋白濃縮等方面[25]。本實驗采用中空纖維柱膜過濾技術對ihFGF-21進行變復性，與shFGF-21相比較，生物活性上無顯著差異，使其在生命科學的領域中又有了新的應用價值，為FGF-21的大規(guī)模生產提供了更實用、更高效的工藝。

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