轉(zhuǎn)popW基因煙草的構(gòu)建及相關(guān)表型分析

王翠，劉紅霞，曹靜，王超，郭堅華

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理學(xué)系，江蘇 南京 210095

2江蘇省生物源農(nóng)藥工程中心，江蘇 南京 210095

3南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095

PopW蛋白是本實驗室前期從青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum ZJ3721中鑒定得到的一個39.79 kDa的新胞外蛋白[1]，它同以前報道的harpin類物質(zhì)具有相同的性質(zhì)：酸性，富含甘氨酸和絲氨酸，缺少半胱氨酸，對熱穩(wěn)定，對蛋白酶敏感，能在非寄主植物煙草上引起過敏反應(yīng)。通過前期研究，我們發(fā)現(xiàn)PopW是青枯勞爾氏菌中廣泛存在的一個定位于寄主細胞壁上，受hrpB基因的調(diào)控，通過Ⅲ型泌出系統(tǒng)分泌到胞外，不影響菌株對寄主致病性的新harpin蛋白[2]。在前期試驗中，我們發(fā)現(xiàn)原核表達的PopW蛋白能夠誘導(dǎo)煙草對TMV產(chǎn)生抗性，同時，PopW蛋白還能促進煙草生長，提高煙草的品質(zhì)，增加中、上等煙的比例[3]。在田間試驗中，我們還發(fā)現(xiàn)PopW蛋白處理能增強番茄對葉霉病、水稻對稻曲病以及黃瓜對霜霉病的抗病性，并且能促進辣椒提前開花，增加黃瓜葉片中葉綠素的含量從而促進其生長，在提高黃瓜產(chǎn)量的同時增加果實中可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸及維生素C的含量，從而提高黃瓜的品質(zhì)[4-6]。PopW蛋白在溫室及田間都表現(xiàn)出了較好的防病、促生效果，在生產(chǎn)上具有較高的應(yīng)用潛力，因此，我們對其原核表達的條件進行了優(yōu)化，在溫室的條件下探究了該蛋白使用的最佳濃度及持效期[4]。深入研究PopW蛋白的誘抗機制將對其在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究將popW基因連接到植物表達載體上轉(zhuǎn)化模式植物三生煙，以研究PopW蛋白在煙草體內(nèi)表達是否和外源施用一樣，可以誘導(dǎo)煙草的抗病性、促進煙草生長，為popW基因在煙草體內(nèi)直接表達產(chǎn)生的效應(yīng)及其機制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為三生煙，于 (25±2)℃溫室內(nèi)培養(yǎng)，光周期為10 h/14 h(光/暗)。大腸桿菌TOP10，青枯勞爾氏菌ZJ3721、YN10，根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA105以及雙元載體pBI121均由本實驗室保存。

Ex-Taq DNA聚合酶，rTaq DNA聚合酶，dNTPs，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ，核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒等均購自愛思敬公司。T4 DNA連接酶購自Promega公司。引物由上海賽百盛生物公司合成。

1.2 植物表達載體的構(gòu)建

以青枯勞爾氏菌ZJ3721的基因組DNA為模板克隆popW基因 (GenBank Accession No.EF080949)，引物序列見表1[2]，將其連接到雙元載體pBI121上的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點之間構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因重組體pB-popW(圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)測序后，將測序序列與原始序列比對確認(rèn)popW序列完全正確。將重組質(zhì)粒用凍融發(fā)轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌EHA105，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，以popW特異性引物對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，凡獲得預(yù)期1 142 bp的特異性條帶的菌落均被認(rèn)為是陽性轉(zhuǎn)化子。保存陽性克隆供轉(zhuǎn)化煙草使用。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化

采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。用含有pB-popW質(zhì)粒的根癌土壤桿菌菌液侵染無菌煙草的葉圓片，侵染后在共生培養(yǎng)基 (MS+6-BA 1 mg/L)中25℃黑暗共培養(yǎng)，2?3 d后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(MS+6-BA 1 mg/L+Km 100 mg/L+Cp 500 mg/L)中分化培養(yǎng)。將長到1 cm以上的不定芽切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中 (1/2 MS+Km 100 mg/L+IAA 0.2 mg/L)誘導(dǎo)生根，待根長好后將無菌小苗的瓶蓋打開在25℃下煉苗2 d后移栽到盆缽中，放到 (25±2)℃溫室培養(yǎng)。本實驗中用作對照的轉(zhuǎn)空載體煙草是用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化不含有外源基因的pBI121質(zhì)粒后獲得。所有用于實驗的轉(zhuǎn)基因煙草植株均為T3代。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定

用CTAB法提取煙草基因組DNA，以popW和CaMV 35S啟動子的特異性引物對轉(zhuǎn)基因煙草進行PCR驗證，引物序列見表1。

圖1 植物表達載體pB-popW的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Construction of plant expression vector with popW.LB:left border;RB:right border;NPTⅡ:neomycin phosphotransferaseⅡ gene;Pro:promoter;Ter:terminator;GUS:β-glucuronidase gene.

表1 PCR擴增所用的引物序列及參數(shù)Table 1 Sequence of PCR prmiers and relative characteristics

采用RT-PCR的方法鑒定煙草葉片中popW基因的表達情況。使用Trizol試劑 (Invitrogen)提取煙草葉片總RNA，進行RT-PCR(具體方法見PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa))分析基因表達量。以真核生物內(nèi)保守表達的EF1a作為參照，RT-PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，利用凝膠分析系統(tǒng) (Kodak Image Station 2000R,The Center for Integrated BioSystems,USA)對基因的表達量進行相對定量。

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS組織化學(xué)染色

采用Jefferson(1987)的染色方法[7]，對轉(zhuǎn)基因煙草進行GUS染色檢測。將出芽后2周的煙草幼苗進行GUS染色，以野生型煙草和轉(zhuǎn)空載體煙草植株作為對照。GUS染色陽性的組織呈現(xiàn)藍色，陰性呈無色或白色。

1.6 轉(zhuǎn)基因煙草的生長測定

將T2代轉(zhuǎn)基因煙草種子表面消毒后鋪于1/2 MS平板上培養(yǎng)，15 d后測定各株系植株的根長，并與野生型煙草和轉(zhuǎn)空載體煙草植株進行比較。將測定完根長的幼苗移栽到穴盤中生長，30 d后從穴盤移栽至盆缽中，移栽至盆缽中60 d后測定煙草植株的各項生長指標(biāo)。

1.7 轉(zhuǎn)基因煙草對TMV的抗性測定

對移栽后6?7周的T3代煙草進行TMV抗性測定，采用摩擦接種法接種TMV[8]。每個株系接種12株煙草，每株接種中部3張完全展開的葉片，接種后的葉片用水輕輕沖洗后置于 (25±2)℃溫室中培養(yǎng)[9]，實驗重復(fù)3次，以野生型三生煙和轉(zhuǎn)空載體煙草作對照。接種72 h后調(diào)查葉片枯斑發(fā)生情況?？共⌒员硎緸檗D(zhuǎn)基因植株與對照相比病斑個數(shù)減少的百分?jǐn)?shù)，即：抗病效果 (%)=[(對照煙草葉片上的平均枯斑數(shù)-轉(zhuǎn)基因煙草葉片平均枯斑數(shù))/對照煙草葉片上平均枯斑數(shù)]×100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) (Data Processing System)中的Duncan’s新極復(fù)差法比較差異顯著性，標(biāo)有相同字母的平均數(shù)表示無顯著差異 (P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測Fig.2 PCR detection of transgenic tobacco plants.(A)PCR detection of transgenic tobacco plants with popW specific primer.(B)PCR detection of transgenic tobacco plants with 35S specific primer;M:DL2000 marker;WT:wild type tobacco plants;E:transformed vector plants;+:plasmid pB-popW as positive control;other lanes are transgenic tobacco plants.

以插入片段的特異性引物popW對根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR檢測，凡獲得1 142 bp特異條帶的菌落均被認(rèn)為是陽性轉(zhuǎn)化子。采用葉盤法將pB-popW質(zhì)粒通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化三生煙，轉(zhuǎn)化煙草經(jīng)過侵染、愈傷形成、產(chǎn)生不定芽、誘導(dǎo)生根等步驟，最終得到51個株系 (T0)的轉(zhuǎn)popW基因煙草。通過繁殖和抗性篩選得到21個T3代純合的轉(zhuǎn)基因煙草株系用于本實驗后續(xù)研究。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測

提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片總DNA，根據(jù)目的基因popW設(shè)計特異引物進行PCR檢測，檢測結(jié)果表明，21個株系的T3代轉(zhuǎn)基因煙草和陽性對照質(zhì)粒pB-popW一樣，均能擴增出1 142 bp的目的基因popW，而野生型煙草和轉(zhuǎn)空載體煙草植株均沒有擴增條帶出現(xiàn) (圖2A)。同時，我們根據(jù)35S啟動子序列設(shè)計引物對轉(zhuǎn)基因煙草植株進行了PCR驗證，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)空載體煙草植株均能擴增出800 bp的預(yù)期大小的片段，而野生型煙草植株沒有出現(xiàn)特異性條帶 (圖2B)。因此，無論是對目的基因popW還是對35S啟動子的PCR檢測結(jié)果都表明popW基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到煙草中。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草中popW基因的RT-PCR分析

為了檢測轉(zhuǎn)基因煙草中popW基因是否表達，提取T3代轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總RNA進行了RT-PCR分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中popW均有表達，且不同株系間表達量存在差異，其中 14-1-2、16-1-1、21-3-1、31-3-3、37-2-1和40-1-1葉片中的popW有較強的表達，而15-3-1、22-1-1、42-2-2和64-3-1表達量較低，同時在野生型以及轉(zhuǎn)空載體煙草植株的葉片中均沒有popW表達 (圖3)。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR分析Fig.3 RT-PCR analysis of transgenic tobacco.WT:wild type tobacco plants;E:transformed vector plants;other lanes are transgenic tobacco plants.

對出芽后2周的煙草幼苗進行GUS組織化學(xué)染色分析，以檢測轉(zhuǎn)基因煙草中目的基因的表達情況。經(jīng)GUS染色液染色，70%乙醇脫色后顯示，轉(zhuǎn)基因煙草葉部和根部都出現(xiàn)了藍色陽性反應(yīng)，而野生型三生煙則為白色 (圖4)。這表明帶有GUS基因的轉(zhuǎn)基因重組載體已經(jīng)轉(zhuǎn)化到煙草中，并且在煙草的不同部位均可以正常表達，但在不同株系中表達量不同，其中14-1-2、16-1-1、21-3-1、31-3-3、37-2-1、40-1-1、42-2-2具有較強的GUS活性，32-1-2、34-1-4、64-3-1的GUS活性較低，而在22-1-1、28-3-1、35-3-1中未檢測到肉眼可見的GUS活性 (圖片未顯示)，結(jié)合RT-PCR的結(jié)果分析可能是因為在這3個轉(zhuǎn)基因煙草株系中popW的表達量極低，導(dǎo)致肉眼不可見。

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的生長測定

為了比較轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草在生長上的差異，我們對轉(zhuǎn)基因煙草的整個生育期進行了觀察，并測定了移栽后60 d的各項生長指標(biāo)。T2代轉(zhuǎn)基因煙草的種子在1/2 MS培養(yǎng)基上生長15 d后，除15-3-1、35-3-1以外，其他株系的根長均顯著長于野生型煙草植株，其中16-1-1、32-1-2、22-1-1的根長分別為野生型的1.7、1.6、1.4倍 (圖5)。轉(zhuǎn)基因煙草在整個生育期都能夠正常生長且在形態(tài)上與野生型煙草沒有差異，移栽60 d后，除9-1-4、16-1-1以外，其他株系的株高、鮮重和干重均大于野生型煙草植株，22-1-1、37-2-1等8個株系的三項指標(biāo)均顯著大于野生型煙草，其中22-1-1的株高、鮮重和干重分別達野生型煙草的1.4、1.7、1.8倍 (圖6)。

圖4 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色分析Fig.4 GUS staining of transgenic tobacco.WT:wild type tobacco plants;E:transformed vector plants;others are transgenic tobacco plants.

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草種子在1/2 MS培養(yǎng)基上生長15 d后的根長Fig.5 Root length of transgenic tobacco seedlings 15 days afer sown in 1/2 MS medium.WT:wild type tobacco plants;E:transformed vector plants;others are transgenic tobacco plants.

2.6 轉(zhuǎn)基因煙草對TMV抗性測定

對生長6?7周的T3代轉(zhuǎn)基因煙草植株進行TMV接種，接種48 h后接種葉片上出現(xiàn)壞死斑(圖7C)，接種TMV 72 h后對接種葉片上的病斑進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，除9-1-4以外，其他轉(zhuǎn)基因煙草葉片上的病斑數(shù)均少于野生型以及轉(zhuǎn)空載體煙草植株 (圖7A,B)。其中有16個株系的轉(zhuǎn)基因煙草植株對TMV的抗病性顯著強于野生型煙草，抗病性最強的株系31-3-3葉片上的病斑數(shù)僅為野生型煙草的0.46倍，防效達54.25%(圖7A,C)。

3 討論

Harpin蛋白是革蘭氏陰性植物病原細菌hrp(Hypersensitive response and pathogenicity)基因編碼的，通過Ⅲ型泌出通道分泌的一類效應(yīng)蛋白[10]。在非寄主上使用Harpins，可引起植物產(chǎn)生多種有益反應(yīng)，如提高作物的抗病、抗蟲能力，促進植物生長和增強植物的抗逆性等[11-17]，同時研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)編碼harpin蛋白基因的作物對干旱脅迫表現(xiàn)出較高的耐受性[18]。盡管harpin蛋白有著上述諸多的功能，但目前只有美國Eden公司的messenger(HarpinEa)得到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，并且人們對harpin蛋白的作用位點及抗病機理也知之甚少，還有待進一步的深入研究。本實驗室前期從青枯勞爾氏菌ZJ3721中鑒定得到的PopW蛋白具有其他harpin蛋白所共有的生物活性，能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生由水楊酸信號通路激發(fā)的系統(tǒng)獲得抗性(SAR)[1-2]，并且通過亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)PopW蛋白定位于植物的細胞壁上。Li和Fan[19]報道，在馬鈴薯中表達的harpinEa,無論hrpN基因前加或不加信號肽，即harpinEa不論是位于細胞內(nèi)還是細胞外，均可以誘導(dǎo)馬鈴薯對晚疫病的抗性。這很可能是因為harpins在植物中的作用位點不只一個，由于作用位點不同，激發(fā)的信號通路也不同[1]。

圖6 轉(zhuǎn)基因煙草移栽后60 d的生長測定Fig.6 Growth assay of transgenic tobacco plants 60 days after transplanting to pots.Plant height(A),fresh weight(B)and dry weight(C)of transgenic tobacco plants 60 days after transplanting to pots.WT:wild type tobacco plants;E:transformed vector plants;others are transgenic tobacco plants.

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草對TMV的抗病測定Fig.7 Resistance detection of transgenic tobacco plants to TMV.(A–B)Disease spot number and biocontrol efficacy of transgenic tobacco 72 h after inoculation with TMV.(C)Symptom of resistant transgenic tobacco against TMV(leaves photographed 72 h after inoculation with TMV;WT:wild type tobacco plants;E:transformed vector plants;others are transgenic tobacco plants.

在本研究中，我們采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片，獲得51株轉(zhuǎn)popW基因煙草，由于在生長過程中管理不善最終僅獲得32株轉(zhuǎn)基因煙草的種子，對獲得的煙草種子進行卡那霉素抗性篩選，通過PCR驗證、RT-PCR分析最終獲得21個株系的T3代轉(zhuǎn)popW基因煙草(圖2和圖3)。PCR及RT-PCR分析的結(jié)果表明，外源基因已成功插入煙草基因組并進行了轉(zhuǎn)錄，但不同株系在轉(zhuǎn)錄水平上存在較大差異 (圖3)，這可能是因為不同的轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的拷貝數(shù)不同，并且整合位點是隨機的[20-21]。我們對PCR分析為陽性的21個轉(zhuǎn)基因煙草株系進行GUS染色，以檢測目的蛋白的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并不是所有的轉(zhuǎn)基因煙草都有肉眼可見的GUS活性，這可能是因為目的蛋白在這些株系中表達量極低，未達到GUS組織化學(xué)染色可檢測的最低量[22-23]。將RT-PCR分析及GUS染色的結(jié)果進行比較，我們發(fā)現(xiàn)popW在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平并不完全一致，其中42-2-2在轉(zhuǎn)錄水平僅有微弱的表達卻有較高的GUS活性，而22-1-1、28-3-1、32-1-2、34-1-4、35-3-1的轉(zhuǎn)錄并不是最低卻只檢測到微弱甚至未檢測到GUS活性，這可能是因為蛋白的表達水平不僅跟轉(zhuǎn)錄有關(guān)，還受翻譯和翻譯后修飾等過程中多個因素的影響[24]。在對轉(zhuǎn)基因煙草的生長測定和抗病性測定中我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉(zhuǎn)基因煙草的生物量都有所增加同時增強了對TMV的抗性 (圖6和圖7)。然而，轉(zhuǎn)popW基因后對煙草的促生及抗病效果與RT-PCR、GUS染色的結(jié)果并沒有相關(guān)性 (圖3和圖4)，這是因為轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的表達及其功能的發(fā)揮是受多方面因素影響的，如目的基因的拷貝數(shù)、插入位點等[20-21]。

轉(zhuǎn)popW基因能促進煙草的生長同時增強煙草對TMV的抗性，這與體外施用PopW蛋白的結(jié)論一致[1-7]。Xu等[25]的報道表明，過表達harpinXoo增強了菊花對黑斑病的抗性，并且能促進菊花的生長；與這一結(jié)果類似，轉(zhuǎn)hrf2基因油菜增強了對菌核病的抗病性，同時提高了油菜的農(nóng)藝性狀，增加了油菜的產(chǎn)量[26]。

此外，與野生型三生煙相比，轉(zhuǎn)基因煙草對青枯病的抗病性也有所增強，一些轉(zhuǎn)基因煙草如1-1-2、34-1-4等在接種病原菌后會快速產(chǎn)生活性氧爆發(fā)及細胞死亡 (另文發(fā)表)，這表明popW基因的表達可能縮短了煙草對病原菌的反應(yīng)時間，從而賦予植物抗病的能力。在今后的研究中我們將選出具有顯著表型的株系對轉(zhuǎn)基因煙草的抗病、促生機制進行進一步的解析。在實驗過程中，我們還發(fā)現(xiàn)與野生型煙草相比轉(zhuǎn)基因煙草對H2O2的耐受性有所增強，在含有一定濃度H2O2的MS平板上轉(zhuǎn)基因煙草的幼苗可以正常生長，而野生型煙草的生長卻受到了抑制，轉(zhuǎn)popW基因煙草抗氧化的機理也是我們今后研究的重點之一。

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