星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化大黃煮散顆粒煎煮工藝

任虹，傅超美，任波，蔣燕萍，嚴(yán)鑫，趙思蕾

·炮制制劑·

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化大黃煮散顆粒煎煮工藝

任虹，傅超美，任波，蔣燕萍，嚴(yán)鑫，趙思蕾

目的：優(yōu)化大黃煮散顆粒煎煮工藝。方法：以加水量(倍)、浸泡時(shí)間和煎煮時(shí)間為考察對(duì)象，對(duì)總蒽醌煎出率和干膏收率進(jìn)行歸一化處理后，以歸一化值為考察指標(biāo)，分別進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化煎煮工藝并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析及驗(yàn)證優(yōu)選出大黃煮散顆粒最佳煎煮工藝。結(jié)果：二項(xiàng)式方程擬合度較高，復(fù)相關(guān)系數(shù)分為R=0.940，預(yù)測(cè)性較好；其優(yōu)化工藝為取大黃煮散顆粒，加入16倍量水，浸泡14 min，煎煮兩次，每次34 min。結(jié)論：星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選大黃煮散顆粒煎煮工藝方法簡(jiǎn)便可靠，具有良好的預(yù)測(cè)性，優(yōu)選的煎煮工藝合理可行。

大黃煮散顆粒；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；效應(yīng)面優(yōu)化法；煎煮工藝

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum.tanguticum Maxim.ex Balf，或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖[1]。味苦、性寒。歸大腸、脾、胃、肝、心經(jīng)。具有瀉下攻積、瀉火解毒、涼血止血、活血祛瘀和清泄?jié)駸岬墓π2]。大黃主要有效成分為蒽醌類化合物，又分為游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌。為提高中藥飲片利用率，以節(jié)約藥材、節(jié)省時(shí)間為目的[3]，實(shí)驗(yàn)將大黃傳統(tǒng)飲片開(kāi)發(fā)成大黃煮散顆粒。中藥煮散顆粒是在傳統(tǒng)煮散基礎(chǔ)之上，結(jié)合現(xiàn)代先進(jìn)科學(xué)技術(shù)，只改變外觀性狀，不加其它任何輔料制成的現(xiàn)代新型中藥飲片。作為對(duì)傳統(tǒng)飲片的一種改革嘗試，中藥煮散顆粒具有悠厚的歷史底蘊(yùn)，是“古為今用、尊古厚今”的體現(xiàn)。由于煮散顆粒只改變了傳統(tǒng)飲片的物理性狀，其粒度的改變定將影響有效成分的浸出，并將為新型中藥飲片的形成奠定一定的基礎(chǔ)。

本課題組前期試驗(yàn)已考察出陳皮、黃柏、干姜、黃連煮散顆粒在不同煎煮時(shí)間點(diǎn)煎出效率均高于傳統(tǒng)飲片[3～6]，在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了考察出大黃最佳臨床煎煮工藝，本實(shí)驗(yàn)選用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化其煎煮工藝。此法常用于優(yōu)化藥材和制劑提取工藝、處方篩選，該方法簡(jiǎn)便、直觀，且預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值[7]。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）；BP211D電子分析天平( 十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius 公司)；BP121S 電子分析天平( 萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius 公司) ； 202-2 型干燥箱( 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠) ；粉碎機(jī)DJ靈巧型（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）。

大黃藥材購(gòu)于成都荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖。大黃素甲醚對(duì)照品（四川省維克奇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120902，純度≥98%），大黃素對(duì)照品（四川省維克奇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120210，純度≥98%），蘆薈大黃素對(duì)照品（四川省維克奇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120723，純度≥98%），大黃酸對(duì)照品（四川省維克奇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120115，純度≥98%），大黃酚對(duì)照品（四川省維克奇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120621，純度≥98%），甲醇(色譜純) ，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃煮散顆粒的制備

按前期研究結(jié)果，將大黃飲片進(jìn)行粉碎，得細(xì)粉，加適量水混勻制得軟材，制成顆粒，干燥，整粒，即得。

2.2 干膏收率的測(cè)定

取大黃煮散顆粒約5 g，精密稱定，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)表1和表2進(jìn)行試驗(yàn)，取各試驗(yàn)安排下的提取液續(xù)濾液定容至100 mL，精密移取50 mL于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，置烘箱于105 ℃干燥3 h，取出移置干燥器中，冷卻后精密稱定重量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 大黃游離型蒽醌的HPLC測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》2010年版一部大黃藥材項(xiàng)下含量測(cè)定方法[1]和文獻(xiàn)[8～10]方法對(duì)各樣品中游離型蒽醌、結(jié)合型蒽醌和總蒽醌的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.3.1 色譜條件 色譜柱DiamonsilTMC18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1 mL﹒min-1；柱溫：30 ℃；理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL對(duì)照品含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚分別為48 μg、279 μg、126 μg、39 μg、39 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取大黃煮散顆粒約5 g，精密稱定，按星點(diǎn)設(shè)計(jì)表1和表2進(jìn)行試驗(yàn)，取各試驗(yàn)安排下的提取液續(xù)濾液定容至100 mL，用移液管取10 mL提取液續(xù)濾液于分液漏斗中，分別加入三次氯仿溶液，每次分別為20 mL、20 mL、10 mL氯仿，待分層后，收集氯仿層溶液，保留水層待用，揮干氯仿液后，用甲醇溶解并定容放置于10 mL容量瓶中，即得大黃煮散顆粒游離型蒽醌供試品溶液。

將上述水層溶液置于圓底燒瓶中，加入20 mL氯仿后，置75 ℃水浴鍋中水浴1 h，收集氯仿層；同法提取三次，每次氯仿液量分別為20 mL、20 mL、20 mL。收集三次氯仿液，揮干氯仿液后，用甲醇溶解并定容放置于10 mL容量瓶中，即得大黃煮散顆粒結(jié)合型蒽醌供試品溶液。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2，6，10，14，18 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積值為縱坐標(biāo)（Y）繪制蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得到回歸方程分別為Y1=6849906.901X1+56791.0125 (R=0.9994), Y2=2674614.421X2-398549.3662 (R=0.9996), Y3=4221682.662X3-104266.6528 (R=0.9991), Y4=7520725.962X4+689412.525 R=0.9991, Y5=2127421.975X5+17573.10795 (R=0.9992)。五種對(duì)照品分別在96 -864 μg，560-5020 μg，252-2268 μg，78-702 μg，78-702 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 大黃煮散顆?？傒祯臏y(cè)定 游離型蒽醌的測(cè)定：取“2.3.3”項(xiàng)下大黃煮散顆粒游離型蒽醌供試品溶液，參照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚的含量測(cè)定。將五種含量結(jié)果相加即得大黃煮散顆粒游離型蒽醌的含量。

結(jié)合型蒽醌的測(cè)定：方法同游離型蒽醌的測(cè)定。

總蒽醌=游離型蒽醌+結(jié)合型蒽醌。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)

試驗(yàn)前，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)對(duì)大黃煮散顆粒煎煮效率各影響因素進(jìn)行了初步的考察。分析結(jié)果后以加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間為考察因素，煎煮次數(shù)為非連續(xù)變量回歸處理較困難，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際，設(shè)定煎煮次數(shù)為2次，其余因素的水平據(jù)試驗(yàn)結(jié)果而定。影響因素及水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 影響因素及水平

表2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 模型擬合

用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，以大黃煮散顆粒總蒽醌煎出率、干膏收率歸一值OD為因變量，對(duì)各自變量因素(A、B、C)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，模型的好壞通過(guò)復(fù)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行判定。

多元線性模型擬合方程如下：

OD=-0.478+0.057-8.25150E-003B+0.0131C（R=0.50,P=0.1972）

二次多項(xiàng)式模型擬合方程如下：

OD=-15.97+1.496A+0.140B+0.243C-6.49E-003AB-8.78E-003AC+5.26E-003BC-0.0345A2-1.962E-003B2-1.770E-003C2（R=0.940,P=0.0012）

由以上分析可知，二次多項(xiàng)式模型復(fù)相關(guān)系數(shù)明顯高于多元線性方程復(fù)相關(guān)系數(shù)，說(shuō)明該煎煮工藝各項(xiàng)指標(biāo)采用二項(xiàng)式方程擬合更為恰當(dāng)，故選擇二項(xiàng)式擬合方程優(yōu)選工藝參數(shù)。

2.6 工藝參數(shù)優(yōu)化和預(yù)測(cè)

因變量曲面圖是三維圖，只能表達(dá)兩個(gè)自變量的函數(shù)，因此固定三個(gè)自變量之一為中值，以擬合的目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用Design Expert 7. 0 統(tǒng)計(jì)軟件繪制因變量三維圖及等高圖。見(jiàn)圖1-3。

圖1 加水量與浸泡時(shí)間對(duì)OD影響的三維圖和等高圖

圖2 加水量與煎煮時(shí)間對(duì)OD影響的三維圖和等高圖

圖3 浸泡時(shí)間與煎煮時(shí)間對(duì)OD影響的三維圖和等高圖

在歸一化處理后得到的OD值中以加水量和浸泡時(shí)間兩因素作圖可知，加水量16～18.31倍，浸泡時(shí)間6.34～17 min，以加水量和煎煮時(shí)間兩因素作圖可知，加水量16～18.31倍，煎煮時(shí)間20.28～34.72 min；以浸泡時(shí)間和煎煮時(shí)間兩因素作圖可知，浸泡時(shí)間6.34～19.33 min，煎煮時(shí)間23.89～34.72 min；綜合以上信息，加水量為16～18.31倍，浸泡時(shí)間6.34～15 min，煎煮時(shí)間23.89～34.72 min。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況和預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，優(yōu)選最佳工藝為：取規(guī)定量大黃煮散顆粒，加入16倍量水，浸泡14 min，煎煮兩次，每次34 min。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)以上所得工藝進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3）

大黃煮散顆粒煎煮工藝條件為：取大黃煮散顆粒，加入16倍量水，浸泡14 min，煎煮兩次，每次34min。

3 結(jié)論與討論

大黃為臨床常用瀉下藥之一，其有效成分為蒽醌類成分。在本試驗(yàn)中以總蒽醌煎出率和干膏收率兩者總體歸一值為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化大黃煮散顆粒的煎煮工藝，試驗(yàn)結(jié)果表明，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)選中藥煮散的煎煮工藝，考察因素的水平范圍更大，同時(shí)采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，可信度較好，方法簡(jiǎn)便可靠，建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，且預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值，優(yōu)選的煎煮工藝合理可行。本試驗(yàn)的結(jié)果可為煮散顆粒在臨床上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

煮散顆粒粒度變小，煎煮溶媒與顆粒接觸面積增大，更利于滲入顆粒內(nèi)部，將有效成分煎出。能更好的提高中藥飲片利用率，大大縮短煎煮時(shí)間，同時(shí)也能節(jié)約中藥飲片用量。但是，煮散顆粒若粉末粒度過(guò)細(xì)，不利于溶液的濾過(guò)操作，因此，在不影響煮散顆粒成型性的前提下，可根據(jù)具體中藥飲片需要選擇較大粒徑的粉末進(jìn)行煮散顆粒的制備。

煮散顆粒能增大有效成分的溶出，但是同時(shí)也可能會(huì)增大有害成分的溶出。因此需要對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的藥效學(xué)對(duì)比研究，確定煮散顆粒的臨床用量。才能保證臨床上安全地使用煮散顆粒這一劑型。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010: 22.

[2] 張廷模.臨床中藥學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2012:136.

[3] 徐曉秋,傅超美,季寧平,等. 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化黃連煮散顆粒煎煮工藝及其與傳統(tǒng)飲片化學(xué)計(jì)量對(duì)比研究[J].中藥與臨床,2012,3(6):20.

[4] 林俊芝,傅超美,毛茜,等. 黃柏飲片與煮散顆粒在不同煎煮時(shí)間點(diǎn)鹽酸小檗堿含量和干膏收率的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(12):41.

[5] 馬雪瑋,傅超美,劉婧,等. 干姜煮散顆粒與傳統(tǒng)飲片在不同煎煮時(shí)間點(diǎn)干膏收率與6-姜辣素含量的對(duì)比研究[J]. 成都大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,31(2):121.

[6] 鄭為騫,傅超美,胡慧玲,等. 陳皮現(xiàn)代飲片與傳統(tǒng)飲片煎出效果對(duì)比研究[J]. 中藥與臨床,2011,2(3):36.

[7] 盧君蓉,傅超美,劉芳,等. 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選丹參中丹參總酚酸的提取工藝[J].中成藥,2012,7(34):1373.

[8] 王彬,韓剛,張學(xué)俊,等.大黃甘草湯單煎液與合煎液中蒽醌類化合物和甘草酸煎出量的變化[J].中成藥,2010,10(32):1794.

[9] 李磊,孫平,馮成強(qiáng). 不同產(chǎn)地野生與栽培掌葉大黃中蒽醌類成分含量的比較[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,9(21):2251.

[10] 孫冬梅,饒梅冰,熊紅,等.大黃不同煎煮時(shí)間對(duì)小承氣湯中結(jié)合型蒽醌含量的影響[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,5(23):53.

（責(zé)任編輯：何瑤）

Optimization decoction process of Dahuang Zhusan Keli by central composite design - response surface method

REN Hong, FU Chao-mei, REN Bo, JIANG Yan-ping, YAN Xin, ZHAO Si-lei//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To optimize the decoction process of Dahuang Zhusan Keli.Method:With the water addition (Times), immersion time and decocting time as the objects of study, the normalized values of the total Anthraquinone extraction rate and yield of dry extract were used as observing indexes. Multiple linear regression and quadratic-ft equation were used to estimate the relationship between independent and dependent variables to choose the optimization decoction process of Dahuang Zhusan Keli by central composite design - response surface method.Result:The results showed that the regression coeffcients of quadratic-ft equation were better for the estimation with R value of 0.940. The optimal conditions of decoction process were 16-fold solvent, 14 minutes soaked，2 times boiling and 34 minutes every time.Conclusion:The established model can well predict the extraction process. The optimized process is reliable for the dode.

Dahuang Zhusan Keli; central composite design; response surface methodology; decoction process

R 283

A

1674-926X(2014)03-004-04

四川省科技支撐計(jì)劃（310931）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

任虹，女，在讀碩士研究生，從事中藥新制劑和新劑型的研究Tel:15882232829 Email:363568917@qq.com

任波，男，講師，主要從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2013-12-26