流動注射分析在食品亞硝酸鹽測定中的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢

張宏康，王中瑗*，李婉婷

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心，廣東 廣州 510300）

流動注射分析在食品亞硝酸鹽測定中的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢

張宏康1，王中瑗2,*，李婉婷1

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心，廣東 廣州 510300）

流動注射分析技術(shù)應(yīng)用于食品中亞硝酸鹽含量的檢測，具有簡便、快速、環(huán)保等特點。本文綜述了近年來流動注射分析技術(shù)在食品亞硝酸鹽檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀。并對各種聯(lián)用方法的原理、測定參數(shù)及其使用范圍等進行了總結(jié)和分析比較，同時還展望了流動注射分析技術(shù)在食品亞硝酸鹽測定中的發(fā)展趨勢。

流動注射分析；食品；亞硝酸鹽

流動注射分析（flow injection analysis，F(xiàn)IA）是1974年丹麥化學(xué)家Ruzicka和Hansen提出的一種新型的連續(xù)流動分析技術(shù)[1]，是在封閉的管路中，在熱力學(xué)非平衡條件下，向連續(xù)流動的載流斷續(xù)地注入一定體積的樣品，試劑與樣品在混合圈中反應(yīng)，然后流過檢測器，由記錄儀記錄其吸光度、電位或者其他物理參數(shù)，一般輸出峰形信號且峰高或峰面積與被測物濃度呈一次或二次相關(guān)，可利用峰面積或峰高對被測物進行定量分析（圖1）。它是近20年來才出現(xiàn)的一項分析技術(shù)，與其他分析技術(shù)相結(jié)合極大地推動了自動化分析和儀器的發(fā)展，成為一門新型的微量、高速和自動化的分析技術(shù)。特點是快速，不要求必須達到化學(xué)平衡，只要狀態(tài)穩(wěn)定就可以。

圖1 流動注射分析儀流程圖Fig.1 Schematic diagram of flow injection analyzer

亞硝酸鹽是一種毒性物質(zhì)，俗稱“工業(yè)用鹽”，是一類無機化合物的總稱，其外觀及滋味都與食鹽相似，人體長期攝入過量的亞硝酸鹽可能引起血紅蛋白變性和消化道癌變甚至可導(dǎo)致人體中毒死亡。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定[2]，人體每天最多攝入亞硝酸鉀或亞硝酸鈉的量為0.2 mg/kg體質(zhì)量。一次性大量攝入亞硝酸鹽，會出現(xiàn)惡心、頭暈、皮膚呈藍褐、藍灰或藍黑色，一般以口唇、指端最為明顯、全身無力、嗜睡，嚴重者呼吸困難、昏迷、抽搐，一般在食后0.5 h內(nèi)發(fā)生，如不及時搶救，可在2 h內(nèi)死亡[3]。

根據(jù)GB2760—2011《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[4]，亞硝酸鈉和亞硝酸鉀主要用于護色劑和防腐劑。根據(jù)規(guī)定可以用于腌臘肉制品，如咸肉、臘肉、板鴨、中式火腿、臘腸；醬鹵肉制品類；熏、燒、烤肉類；油炸肉類；西式火腿類，如熏烤、煙熏、蒸煮火腿等；肉灌腸類；發(fā)酵肉制品類；肉罐頭類等八類肉制品中，其最大使用量為0.15 g/kg。具體殘留量除西式火腿為70 mg/kg、肉罐頭類為50 mg/kg外，其他均為30 mg/kg。建立靈敏、快速、高效的食品中亞硝酸鹽的檢測方法尤為重要。當前我國食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的標準分析方法有鹽酸萘乙二胺分光光度法和離子色譜法[5]。由于這些方法使用的有機試劑毒性較大，而且時間耗費比較長，近年來越來越多研究人員將流動注射技術(shù)運用在食品中亞硝酸鹽的測定當中，以減小有毒試劑用量，避免過多的人手接觸，實現(xiàn)簡便、環(huán)保、快速大批量檢測[6]。

本文綜述了近年來國內(nèi)流動注射分析在食品亞硝酸鹽檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀，對各種聯(lián)用方法的原理、測定參數(shù)及其使用范圍等進行了歸納總結(jié)，分析比較了各種方法的優(yōu)劣，并對該領(lǐng)域的發(fā)展進行了展望，以期對我國流動注射技術(shù)測定食品中亞硝酸鹽的發(fā)展提供一定的參考。

1 流動注射分析測定食品中的亞硝酸鹽

1.1 流動注射分光光度法

流動注射分光光度法一般是基于重氮化-偶聯(lián)反應(yīng)，即亞硝酸鹽先與對氨基苯磺酸等發(fā)生重氮反應(yīng)，再與偶聯(lián)試劑（鹽酸萘乙二胺、α-萘胺、N-（1-萘基）乙二胺、N-（1-萘基）乙烯二胺鹽等）發(fā)生偶合反應(yīng)，形成有色染料，其顏色深淺與亞硝酸鹽含量成正比關(guān)系，從而可以用紫外-可見分光光度計來檢測其中的亞硝酸鹽含量[7-8]。流動注射分光光度法目前主要用于檢測蔬菜類、肉類及水質(zhì)中的亞硝酸鹽含量。

任乃林等[9]將蔬菜勻漿后以超聲波提取、活性炭脫色后，結(jié)合流動注射技術(shù)，建立流動注射分光光度法測定蔬菜中的亞硝酸鹽含量。將樣品中的亞硝酸鹽與0.4%對氨基苯磺酸重氮化，再與0.2% N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽偶合，在流動注射分析裝置中，混合液在管路中停留300 s，接近完全反應(yīng)，形成玫瑰色的偶氮染料，在540 nm波長處測定吸光度，可直接得到亞硝酸鹽的含量。該亞硝酸鹽檢測方法的線性范圍為0.1～2.4 μg/mL，檢出限為0.01 μg/mL，相對標準偏差介于0.03%～1.8%之間，樣品測定頻率為10 個樣/h。該方法精密度和準確度都很高，操作步驟比較簡單、穩(wěn)定，適用于不同亞硝酸鹽含量蔬菜樣品的測定。吳金苗等[10]應(yīng)用流動注射法實現(xiàn)快速現(xiàn)場監(jiān)測水中的亞硝酸鹽含量，線性范圍為0～60 μg/L，相對標準偏差為4%。將磺胺和鹽酸萘乙二胺配成顯色劑，結(jié)合流動注射分析儀，并用推動液（3%氯化銨）推動樣品與顯色劑混合，經(jīng)過反應(yīng)盤管生產(chǎn)紅色偶氮染料，在535 nm波長處測定吸光度，從而達到快速監(jiān)測水中的亞硝酸鹽含量。該方法精密度好，大大降低了儀器裝置的繁雜性，節(jié)省試劑，預(yù)先將磺胺與鹽酸萘乙二胺配成顯色劑，使操作更加簡便，有利于在線分析。

Brabcova等[11]基于亞硝酸鹽和鹽酸介質(zhì)中的利凡諾反應(yīng)，利用流動注射分光光度法測定環(huán)境樣品中的亞硝酸鹽。得到的重氮鹽在520 nm波長處測定吸光度。該方法亞硝酸鹽的檢出限為0.14 mg/L。而Chen?Hui等[12]則基于亞硝酸鹽和硫酸介質(zhì)中的N-苯基鄰氨基苯甲酸反應(yīng)得到有色物質(zhì)，利用流動注射分光光度法在410 nm波長處測定吸光度，檢出限為2.5 ng/mL。Guerrero等[13]則利用硝酸鹽和原黃素的反應(yīng)通過流動注射分光光度法來進行檢測。

1.2 流動注射催化（褪色）光度法

催化（褪色）光度法是在普通光度法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的高靈敏度光度法，具有靈敏度高、檢出限低等特點。一般是指基于在某種介質(zhì)中，亞硝酸根離子催化某種氧化還原褪色反應(yīng)（所用氧化劑主要有溴酸鉀、氯酸鉀、溶解氧、過硼酸鈉和過氧化氫等；所用指示劑主要為偶氮染料、三苯甲烷類染料、對氮蒽染料及蒽醌類染料等），褪色程度與亞硝酸鹽含量成正比關(guān)系，從而可以用紫外-可見分光光度計來檢測其中的亞硝酸鹽含量[14-17]。

張責(zé)珠等[18]利用在磷酸介質(zhì)中，亞硝酸鹽能催化溴酸鉀氧化羅丹明B褪色反應(yīng)的原理，建立了停留式流動注射催化光度法，該方法是以1.1 mol/L的磷酸溶液與4.0×10-5mol/L羅丹明B混合為一路進樣，樣品溶液和8.5×10-2mol/L的溴酸鉀溶液分別為二、三路進樣，在30 ℃的反應(yīng)管中停留50 s，于555 nm波長處測定其吸光度。該法適用于水中痕量亞硝酸鹽的測定，檢出限為2.4×10-10g/mL，具有高靈敏度，高選擇性，簡單快速的特點。

黃志勇等[19]利用硫酸介質(zhì)中亞硝酸根催化溴酸鉀氧化結(jié)晶紫褪色反應(yīng)建立了反向停留流動注射光度分析法。首先將硫酸（0.1 mol/L）與溴酸鉀溶液（0.08 mol/L）混合，再與結(jié)晶紫及樣品混合后推入反應(yīng)盤管停留30 s，在600 nm波長處測定吸光度。檢出限為0.75 μg/L，在0.01～0.1 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可達到準確、可靠、快速測定飲用水及其他食品中的微量亞硝酸鹽含量。而?Zhang Zhiqi等[20]在磷酸介質(zhì)中進行了類似研究。

袁東等[21]利用一氯乙酸緩沖溶液中亞硝酸根對溴酸鉀氧化亮綠具有催化的作用建立了流動注射催化光度法。預(yù)先將pH 2.7的一氯乙酸緩沖溶液與1.12×10-3mol/L的亮綠溶液按3∶2的體積比混合8 h以上，再用流動注射儀控制溴酸鉀（0.15 mol/L）和混合液流量為0.8 mL/min，試樣和載流流量為1.5 mL/min，在室溫下經(jīng)過100 cm（內(nèi)徑為0.5 mm）的反應(yīng)圈進行充分地反應(yīng)混合，在624 nm波長處測定吸光度。檢出限為7.44×10-4mg/L，線性范圍為0.04～0.36 mg/L，測定頻率為60 次/h，相對標準偏差為1.1%。該方法要該方法適合測定自來水中的痕量亞硝酸鹽含量。

龔正君等[22]利用亞硝酸鹽對氯酸鈉與亞甲基藍發(fā)生的褪色反應(yīng)有催化作用從而建立流動注射光度法。該方法在磷酸（0.80 mol/L）和硫酸（0.06 mol/L）混合介質(zhì)中，結(jié)合流動注射技術(shù)，將樣品、亞甲基藍（50 μmol/L）和氯酸鈉（0.2 mol/L）于80 ℃條件下充分混合反應(yīng)后在670 nm波長處測定。檢出限為1 μg/L，線性范圍為質(zhì)量濃度5～150 μg/L和150～1 000 μg/L。該方法與國家標準的光度法比，有反應(yīng)靈敏、試劑環(huán)保、操作簡單、自動化等優(yōu)點。

1.3 流動注射化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法是具有靈敏、快速、操作簡單、重現(xiàn)性好、可在線分析等優(yōu)點而發(fā)展起來的一種方法，但是其選擇性一般較差，所以排除干擾是完善化學(xué)發(fā)光法的一個重要方面。該方法一般先將亞硝酸根轉(zhuǎn)化為一氧化氮，在氣相中測定一氧化氮與臭氧反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光，但是這種方法儀器成本較高[23]。后來慢慢發(fā)展為基于亞硝酸根在特定pH值介質(zhì)中能加強或減弱化學(xué)發(fā)光體系的化學(xué)發(fā)光偶合反應(yīng)，用微光檢測儀就可以完成檢測。從而間接測定了亞硝酸鹽的含量[24]?；瘜W(xué)發(fā)光法主要使用反應(yīng)體系為魯米諾、羅丹明6-G、酸性鉻藍K等[25-26]。

龔正君等[27]利用亞硝酸根在酸性條件下與過氧化氫反應(yīng)，其產(chǎn)物與堿性魯米諾反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，從而建立了流動注射化學(xué)發(fā)光法檢測水中的亞硝酸鹽含量。使用0.1 mol/L硫酸作為體系中的催化劑，用0.3 mol/L氫氧化鈉為1×10-8mol/L的魯米諾提供堿性條件，并使用100 μg/mL過氧化氫溶液與之發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。利用流動注射分析儀以2 mL/min的流速進樣，測定反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強度，從而計算出亞硝酸鹽的含量。該方法檢出限為1.6×10-3μg/mL，線性范圍是3.3×10-3～3.3 μg/mL，儀器設(shè)備簡單，靈敏度高，線性范圍寬，而且避免二次污染的優(yōu)點，對水中亞硝酸鹽在線檢測提供了一種可靠的而簡便的方法。Yaqoob等[28]也采用類似方法對新鮮水中的亞硝酸鹽進行了測定。

肖新峰等[29]利用在酸性介質(zhì)中，碘離子與亞硝酸根快速反應(yīng)產(chǎn)生碘，碘氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，并結(jié)合流動注射技術(shù)建立流動注射化學(xué)發(fā)光測定痕量亞硝酸根的方法，從而實現(xiàn)對痕量亞硝酸根的快速檢測。使用HCl濃度為0.04 mol/L、KI質(zhì)量分數(shù)為0.7%、魯米諾濃度為4.0×10-4mol/L、混合反應(yīng)管長度為2.5 m。魯米諾從主泵進樣，流速為10 r/min；其他溶液從副泵進樣，流速為20 r/min。主副泵運行時間為17 s。采樣速率為20次/min。檢出限為0.5 μg/L，線性范圍為1.0～10.0 μg/L以及10.0～100.0 μg/L。本方法已對水樣、茶葉、大蒜、西紅柿等得亞硝酸鹽含量進行測定，并取得理想的效果。

吳婉娥等[30]利用亞硝酸根對溴酸鉀-酸性鉻藍K體系的化學(xué)發(fā)光有顯著的增強作用而建立了檢測亞硝酸鹽的新方法。使用0.5 mol/L的硫酸作為酸性介質(zhì)、0.1 mol/L溴酸鉀作為氧化劑、1.0×10-4mol/L酸性鉻藍 K作為發(fā)光劑，進樣流速為2.5 mL/min，從進樣閥到微光檢測間的管長為40 cm。該方法的檢出限為1.1×10-10mol/L。線性范圍為1.0×10-8～8.0×10-5mol/L，適合用于對水樣進行檢測，除具有快速、簡單、靈敏度高的特點外，選擇性較魯米諾發(fā)光體系偶合反應(yīng)方法好，不易被干擾。

王書民等[31]利用亞硝酸鹽對高錳酸鉀-乙二醛化學(xué)發(fā)光體系的抑制作用，建立了亞硝酸鹽的流動注射發(fā)光測定的方法。該方法與之前方法不同的是，亞硝酸鹽在這個反應(yīng)中的作用并不是增強而是減弱發(fā)光強度。使用高錳酸鉀的濃度為1.0×10-3mol/L、鹽酸溶液的濃度為0.4 mol/L、乙二醛溶液的體積分數(shù)為6%。采用管長12 cm，從進樣閥到檢測器間的管長為10 cm，所有管道的流速控制在3 mL/min。檢出限為1×10-9mol/L，線性范圍為1.0×10-8～1.0×10-3mol/L。本方法已對肉制品中亞硝酸鹽含量進行測定，并得到可觀的結(jié)果，與鹽酸萘乙二胺分光度法檢測出的結(jié)果沒有很大差異。

王學(xué)鋒等[32]利用亞硝酸根對魯米諾-溴酸鉀體系的化學(xué)發(fā)光具有顯著增強作用，結(jié)合流動注射技術(shù)，建立了一種簡單、快速測定亞硝酸根的方法。該實驗發(fā)現(xiàn)亞硝酸根與溴酸根的反應(yīng)產(chǎn)物參與魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)得到的響應(yīng)信號是最大的。實驗使用流速為3.6 mL/min，管道內(nèi)徑為0.8 mm，采樣環(huán)長度為15 cm，選擇0.18 mol/L的氫氧化鈉作為魯米諾溶液（1.0×10-6mol/L）的介質(zhì)，選擇0.05 mol/L的硫酸作為溴酸鉀溶液（0.03 mol/L）的介質(zhì)。經(jīng)過流動注射反應(yīng)管后進入波長為425 nm的熒光分光光度計進行檢測。檢出限為2.0×10-3mol/L，線性范圍為4.0×10-3～4.0 mg/L。該方法適用于茶葉和蔬菜中的亞硝酸鹽含量的測定。

2 結(jié) 語

目前亞硝酸鹽對于人類來說就是雙刃劍，一方面它是一種公認的潛在致癌物，另一方面它能抑制肉毒梭狀芽孢桿菌生長，目前還無更優(yōu)的替代物。因此目前人類還離不開它，所以在食品工業(yè)中如何安全使用亞硝酸鹽備受關(guān)注[33]。

流動注射具有操作簡便、試劑試樣用量少、分析速度快、精度高、可與不同類型的檢測手段聯(lián)用等優(yōu)點，適合現(xiàn)代分析監(jiān)測和大批量樣品分析的要求，發(fā)展較快。這就開啟了流動注射法檢測食品中亞硝酸鹽的新局面[9,34-39]。

到目前為止，食品中亞硝酸鹽含量的檢測方法有很多，分光光度法、催化光度法、化學(xué)發(fā)光法、離子色譜法、熒光光度法、示波極譜法、核固紅共振光散射法等[40-42]。但是與流動注射聯(lián)用的方法目前只有分光光度法、催化光度法、化學(xué)發(fā)光法。而且也只是少部分研究成果與流動注射技術(shù)結(jié)合使用，還有很多研究成果沒有進一步與流動注射結(jié)合使用，提高檢測效率，減少試劑用量，實現(xiàn)環(huán)保型檢測。流動注射與其他檢測方法聯(lián)用分析測定食品中的亞硝酸鹽含量的研究有很多，這些方法有各自的優(yōu)缺點，適合不同樣品的檢測，但是每一種方法都是借助流動注射這個技術(shù)而達到更快速、更高效、更自動化和大批量檢測的效果。因此，流動注射和其他分析方法聯(lián)用的檢測技術(shù)將會成為食品中亞硝酸鹽含量檢測技術(shù)發(fā)展的一個方向；需要不斷地研究優(yōu)化流動注射和其他檢測方法聯(lián)用的實驗條件、儀器條件，以尋找最有效、最好的方法來測定食品中的亞硝酸鹽。

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Application and Development of Flow Injection Analysis in the Determination of Nitrite in Foodstuffs: A Review

ZHANG Hong-kang1, WANG Zhong-yuan2,*, LI Wan-ting1
(1. College of Light Industry and Food, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2. South China Sea Environment Monitoring Center, State Oceanic Administration, Guangzhou 510300, China)

Flow injection analysis is applied to determine the nitrite content in foodstuffs with some advantages such as simple, fast and environment-friendly. The recent application of flow injection analysis in the determination of nitrite in foodstuffs is reviewed in this paper. The principles, measuring parameters and application scopes of flow injection analysis combined with other analytic methods are summarized and compared. Future trends in the application of flow injection analysis to determine nitrite in foodstuffs is also discussed.

flow injection analysis; foodsuffs; nitrite

TS207.3

A

1002-6630（2014）21-0270-04

10.7506/spkx1002-6630-201421053

2014-01-14

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（41406093）；廣東省教育廳科技創(chuàng)新基金項目（2013KJCX0103）；國家海洋局青年海洋科學(xué)基金項目（2013513）；國家海洋局南海分局局長基金項目（1328）

張宏康（1972—），男，博士后，研究方向為食品分析與加工新技術(shù)。E-mail：zhkuzhk@163.com

*通信作者：王中瑗（1980—），女，工程師，博士，研究方向為分析化學(xué)。E-mail：zhongyuan764@126.com