SAFE-GC-MS分析酸牛奶揮發(fā)性成分

劉南南，鄭福平,2,*，張玉玉,2，范婷婷，黃明泉,2，陳海濤,2，劉玉平,2，謝建春,2，孫寶國,2

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048）

SAFE-GC-MS分析酸牛奶揮發(fā)性成分

劉南南1，鄭福平1,2,*，張玉玉1,2，范婷婷1，黃明泉1,2，陳海濤1,2，劉玉平1,2，謝建春1,2，孫寶國1,2

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048）

采用溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法萃取原味酸牛奶揮發(fā)性成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品對照對揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，采用面積歸一化法加鄰二氯苯作內(nèi)標(biāo)定量，共鑒定出揮發(fā)性成分52 種，其中酸12 種、醛2 種、酮5 種、醇2 種、酯3 種、內(nèi)酯2 種、烯烴4 種、烷烴17 種、其他5 種。其中，對酸牛奶風(fēng)味影響較大的可能有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸稀酸、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮、壬醛、香蘭素、3-甲基-2-丁烯-1-醇、十六硫醇、丁位癸內(nèi)酯、丁位十二內(nèi)酯等。

酸牛奶；溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；揮發(fā)性成分；保留指數(shù)；標(biāo)準(zhǔn)品

酸奶由牛奶發(fā)酵制成，主要原料是牛 奶、蔗糖和乳酸菌發(fā)酵劑，是一種功能獨特的營養(yǎng)品，不僅保存了牛奶中所有的營養(yǎng)成分，而且能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)微生物的平衡。由于酸奶具有口味酸甜、細(xì)滑的特點，且營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛[1]。酸奶中的風(fēng)味化合物可能是乳酸菌代謝產(chǎn)生的，這些風(fēng)味化合物主要來源于乳糖、酯類、檸檬酸或蛋白質(zhì)（氨基酸）的微生物的代謝，或酶及化學(xué)的轉(zhuǎn)變[2]。酸奶中的風(fēng)味物質(zhì)主要有揮發(fā)性酸、羥基化合物、醇類、酯類等[3]。關(guān)于酸奶風(fēng)味的提取方法，國內(nèi)外報道較多的為固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）法[4-5]。王偉君等[6]采用同時蒸餾萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（simultaneous distillation extraction and gas chromatography-mass spectrometry，SDE-GCMS）聯(lián)用技術(shù)，測定發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)；劉寧寧等[7]采用碘滴定法和鄰苯二胺比色法測定發(fā)酵乳中的乙醛和雙乙酰含量；郭文奎等[8]利用SPME-GC-MS聯(lián)用測定酸奶發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分；李寧等[9]用溶劑輔助蒸發(fā)（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）、SDE和頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）3 種方法萃取結(jié)合GC-MS分析新疆發(fā)酵駱駝乳揮發(fā)性成分。

SAFE作為一種溫和的揮發(fā)性成分提取方式，在中高真空和接近室溫的條件下，利用水或有機(jī)溶劑的快速蒸發(fā)，輔助揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的蒸發(fā)，除去難揮發(fā)組分，得到的萃取物沒有“煮熟”味，香味自然逼真[10]，適合液態(tài)乳制品等食品中揮發(fā)性成分提取[11]。目前關(guān)于SAFE提取揮發(fā)性成分的研究報道，主要集中在果蔬[12-15]、酒[16]、肉制品[17-18]和乳制品[19]。

本實驗采用SAFE裝置提取酸牛奶中的揮發(fā)性成分，意在解決SPME法萃取揮發(fā)性成分過程中由于吸附競爭及萃取纖維頭吸附容量受限導(dǎo)致無法有效萃取樣品中的痕量揮發(fā)性成分的問題[20]，與SDE法相比，萃取條件溫和，避免了熱敏性揮發(fā)性成分的損失，為乳制品及其他液體樣品的揮發(fā)性成分的分離、分析提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三元原味酸牛奶（180g，袋裝）市售，放于冰箱內(nèi)冷藏備用。

二氯甲烷（分析純，重蒸后使用）、無水硫酸鈉（分析純）、氯化鈉（分析純）、C7～C30正構(gòu)烷烴（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸、丁酸、乙偶姻等標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SAFE裝置 定制加工；XDS5復(fù)合渦輪分子泵英國Edwards公司；N-EVAP111-12位干浴氮吹儀 美國Organomation Associates公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配MSD ChemStationE.02.01.1177數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和NIST 11質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

圖1 SAFE裝置示意圖[21]Fig.1 Schematic view of SAFE equipment[21]

如圖1所示，將360 g酸牛奶經(jīng)滴液漏斗1緩慢滴入蒸餾燒瓶2（1000 mL）內(nèi)，超級恒溫水槽3和循環(huán)水的溫度均為50 ℃，在冷阱5和冷阱7中加入液氮，分子渦輪泵使系統(tǒng)壓力降至5×10-3Pa左右開始滴加樣品，滴加約1 h，滴加完成后繼續(xù)蒸發(fā)30 min。待500 mL收集燒瓶6內(nèi)提取液自然融化后，用50 mL二氯甲烷萃取提取液4次，合并萃取液。無水Na2SO4干燥，過濾，得澄清的二氯甲烷萃取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL，氮吹至0.5 mL備用。

1.3.2 GC-MS分析

色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度50 ℃，以3 ℃/min升到180 ℃，再以6 ℃/min升到230 ℃，保持10 min；載氣流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1μL；不分流。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲5 min；質(zhì)量掃描范圍40～450 u。

1.3.3 定性定量分析

定性分析：運用NIST 11譜庫檢索，保留匹配度不小于60的成分；通過計算保留指數(shù)結(jié)合文獻(xiàn)保留指數(shù)進(jìn)一步對化合物進(jìn)行定性，對羧酸和其他可能對酸牛奶風(fēng)味有重要影響到化合物通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步定性。

定量分析：采用面積歸一化法對各組分進(jìn)行定量分析，得到各組分的相對含量。進(jìn)樣時，在樣品進(jìn)樣后立刻進(jìn)1 μL 100 μg/mL的鄰二氯苯做內(nèi)標(biāo)，通過峰面積比值計算各組分含量。

2 結(jié)果與分析

圖2 酸牛奶揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of volatiles in yogurt

表1中保留了匹配度不小于60，或者文獻(xiàn)保留指數(shù)與樣品保留指數(shù)相差30以內(nèi)，或者有標(biāo)準(zhǔn)品比對的化合物，并認(rèn)為是可靠的。

從表1可以看出，酸牛奶經(jīng)SAFE-GC-MS分析，得到的揮發(fā)性成分主要是酸類（27.82%）、酮類（28.97%）、醛類（0.28%）、醇類（0.49%）、酯類（0.24%）、內(nèi)酯類（0.42%）、烯烴類（0.85%）烷烴類（8.93%）及其他類化合物（8.24%）。鑒定出的含量較高的化合物（相對峰面積大于1%）有丁酸、己酸、辛酸、癸酸、苯甲酸、棕櫚酸、乙偶姻、2,6,10,14-四甲基十五烷、二十二烷、2,6-二叔丁基對甲酚、2,4-二叔丁基苯酚。

表1 酸牛奶揮發(fā)性成分Table 1 Volatiles identified in yogurt

通常認(rèn)為酸類作為酸牛奶的主要揮發(fā)性物質(zhì)主要表現(xiàn)在滋味上[22]，也有報道稱揮發(fā)酸對酸牛奶風(fēng)味作用不大的結(jié)論并不一定正確，它至少對酸牛奶的風(fēng)味強(qiáng)度有相對較大的影響[23]，是酸牛奶清爽口感的來源[24]。酸牛奶中的脂肪酸源于脂肪的降解。本實驗共檢測到酸12 種，其中，乙酸具有淡淡的酸味，丁酸具有多汁味、奶油味，己酸有油脂味，辛酸具有清香，癸酸表現(xiàn)出油脂味、腐臭味。檢測到不飽和脂肪酸1 種（9-癸稀酸），呈顯著脂肪酸和蠟香，略有果香和乳香[25]。另外，有機(jī)酸的保健功能也有報道[26]。

酮類物質(zhì)多由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解或微生物代謝產(chǎn)生。酮類物質(zhì)使酸牛奶具有特征的風(fēng)味。乙偶姻具有令人愉快的奶香氣、微甜、乳脂氣息，是本實驗酸牛奶中含量最高的揮發(fā)性成分，文獻(xiàn)報道的酸牛奶中乙偶姻含量在1.2～28.2 μg/g，測得量（13.4 μg/g）與文獻(xiàn)[27]相符；2-壬酮具有果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味；2-十一酮具有蠟香、脂肪香，并帶有奶油、乳酪的味道[25]。

檢測到醛類2 種。壬醛具有蠟香、脂肪香；香蘭素具有甜香、奶油香[25]。

醇類化合物主要來自脂肪氧化，有文獻(xiàn)報道飽和醇的風(fēng)味閾值較高，對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，不飽和醇的風(fēng)味閾值較低，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[28]。

內(nèi)酯類化合物，雖然含量較少但閾值較低，對酸牛奶的風(fēng)味起重要作用。內(nèi)酯類化合物源于脂肪的降解，由4或5-羥基酸經(jīng)環(huán)化反應(yīng)生成。丁位癸內(nèi)酯具有桃子、乳脂香氣；丁位十二內(nèi)酯具有脂肪、奶油、牛奶、堅果的氣味[25]。對不同品牌酸牛奶香氣成分的研究表明，內(nèi)酯類化合物可以增添酸牛奶的奶香氣息[29]。

硫醇是含硫氨基酸分裂所得，硫醇閾值很小，故硫醇雖含量低，但對風(fēng)味影響不見得小。

檢測到的2,6-二叔丁基對甲酚為食品抗氧化劑，異丙醚、二甲基砜、2,4-二叔丁基苯酚的來源有待進(jìn)一步研究。

對于文獻(xiàn)中報道的酸牛奶中的典型香味成分乙醛，通過SAFE萃取沒有檢測到，可能是由于GC-MS分析過程中設(shè)有溶劑延遲（5 min），根據(jù)乙醛的文獻(xiàn)保留指數(shù)推算出乙醛出峰時間在溶劑延遲以內(nèi)，被溶劑峰掩蓋。

3 結(jié) 論

酸牛奶經(jīng)SAFE萃取、GC-MS分析，得到的揮發(fā)性成分主要是酸類（27.82%）、酮類（28.97%）、醛類（0.28%）、醇類（0.49%）、酯類（0.24%）、內(nèi)酯類（0.42%）、烷烴類（8.93%）及其他類化合物（8.24%）。其中，對酸牛奶風(fēng)味影響較大的可能有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮、壬醛、香蘭素、3-甲基-2-丁烯-1-醇、十六硫醇、丁位癸內(nèi)酯、丁位十二內(nèi)酯。

實驗采用SAFE結(jié)合GC-MS分析對酸牛奶的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，克服了同時蒸餾萃取時間長、對熱敏性香味成分影響較大的難題。與固相微萃取相比，能夠更全面的萃取酸牛奶中的揮發(fā)性成分。但是由于溶液萃取、濃縮過程中對沸點較低及含量較低的化合物有一定損失，還需通過與其他萃取手段結(jié)合進(jìn)行深入分析。

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Analysis of Volatiles in Yogurt by Solvent-Assisted Flavor Evaporation and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Nan-nan1, ZHENG Fu-ping1,2,*, ZHANG Yu-yu1,2, FAN Ting-ting1, HUANG Ming-quan1,2, CHEN Hai-tao1,2, LIU Yu-ping1,2, XIE Jian-chun1,2, SUN Bao-guo1,2
(1. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Volatiles in plain yogurt were extracted by solvent-assisted flavor evaporation (SAFE) and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) by combination of their retention indices with those of standards. Area normalization method was used for quantitative analysis and 1,2-dichlorobenzene was used as internal standard. A total of 52 volatiles were identified, including 12 acids, 2 aldehydes, 5 ketones, 2 alcohols, 2 lactones, 3 esters, 4 olefins, 17 hydrocarbons, and 5 other compounds. The main volatile flavor constituents in yogurt i ncluded acetic acid, butanoic acid, hexanoic acid, octanoic acid, n-decanoic acid, 9-decenoic acid, acetoin, 2-nonanone, 2-undecanone, nonanal, vanillin, 3-methyl-2-buten-1-ol, 1-hexadecanethiol, delta-decalactone, and delta-dodecalactone.

yogurt; solvent-assisted flavor evaporation (SAFE); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); volatiles; retention indices; standards

TS252.5

A

1002-6630（2014）22-0150-04

10.7506/spkx1002-6630-201422028

2014-06-30

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100903）

劉南南（1991—），女，碩士研究生，研究方向為香料化學(xué)。E-mail：liunan_0315@126.com

*通信作者：鄭福平（1969—），男，教授，博士，研究方向為香料化學(xué)。E-mail：zhengfp@th.btbu.edu.cn