響應(yīng)面法優(yōu)化黃粉蟲蛋白制備ACE抑制肽的條件

崔 楠，陶曉赟，李 娟，陳 健，趙立儀，孫愛東*

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

響應(yīng)面法優(yōu)化黃粉蟲蛋白制備ACE抑制肽的條件

崔 楠，陶曉赟，李 娟，陳 健，趙立儀，孫愛東*

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

以黃粉蟲蛋白粉為原料，利用酶解技術(shù)對制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)，確定木瓜蛋白酶的酶解工藝，利用酶標(biāo)法測定酶解產(chǎn)物的ACE抑制率，研究底物質(zhì)量濃度、加酶量、pH值、酶解時間、酶解溫度對ACE抑制肽活性的影響。結(jié)果表明：當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為7 g/100 mL、加酶量1%、pH 6.5、酶解時間7 h、酶解溫度55 ℃時，黃粉蟲蛋白粉酶解產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)到58.86%。

黃粉蟲蛋白粉；木瓜蛋白酶；ACE抑制肽；酶解條件

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種膜結(jié)合的二肽羧基酶[1]，對人體血壓有重要的調(diào)控作用。ACE通過水解血管緊張素Ⅰ羧基末端的二肽而形成血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ能引起血管平滑肌的強(qiáng)烈收縮，引起血壓升高[2-3]。同時，ACE能使舒緩激肽（人體降壓系統(tǒng)中有舒張血管功能的激肽）失活[4]。因此，抑制ACE活性對降低血壓有著積極的影響。而化學(xué)合成的降壓藥物對人體有一些毒副作用[5]，食源性蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后得到的降壓肽憑借其食用安全性高的特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[6]。因此從食源性材料中分離得到ACE抑制肽，是未來研制降血壓藥物的一個趨勢[7]。目前，已在多種食源性蛋白中分離得到了ACE抑制肽，這類食源性蛋白又可分為幾類，一類是來源于天然植物，如花生、大豆、菜籽、玉米等[8-15]；一類來源于動物，如蛋清、蠶蛹、小黃魚等[16-20]；還有一類來源于天然微生物，目前發(fā)現(xiàn)的有干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌等[21-22]。目前，以黃粉蟲蛋白為原料制備ACE抑制肽尚未見報道。

黃粉蟲（Terebrio molitor L.）也叫大黃粉蟲、黃粉甲，俗稱面包蟲，屬昆蟲綱，鞘翅目，擬步行蟲科，粉蟲屬[23]。黃粉蟲蛋白含量高、氨基酸種類齊全、含量豐富，目前已有報道利用其制備抗氧化肽[24]、氨基酸保健口服液[25]。Miyoushi等[26]的相關(guān)報道表明，ACE更傾向與同疏水性氨基酸的底物結(jié)合。黃粉蟲中含有大量的疏水性的氨基酸[27]，因此以黃粉蟲作為制備ACE抑制肽的原料是可行的。本實(shí)驗(yàn)以脫脂黃粉蟲蛋白粉作為原料，用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解[28]，利用酶標(biāo)儀測定ACE抑制活性[29]，研究在酶解過程中其ACE抑制率的變化，確定酶解黃粉蟲ACE抑制肽制備的最佳工藝條件，以期為深入加工、開發(fā)黃粉蟲蛋白資源及擴(kuò)展ACE抑制肽的制備原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂黃粉蟲蛋白粉（蛋白質(zhì)含量63.17%） 重慶涪江生物科技有限公司。

木瓜蛋白酶 PTN6.0S（1.89×104U/g）、ACE、N-［3-(2-呋喃)丙烯醇酰］-2-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG）美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS4恒溫水浴鍋 上海躍新科學(xué)儀器廠；LB941酶標(biāo)儀 德國Berthold公司；臺式冷凍離心機(jī)、FD-1冷凍干燥機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；PHS-25 pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；FA10004A電子天平 上海精天精密儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 ACE抑制肽樣品制備工藝流程

黃粉蟲蛋白粉→蒸餾水溶解→加酶→恒溫酶解→滅酶（沸水浴10 min）→4 ℃、10 000 r/min離心10 min →取上清→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→冷凍干燥→ ACE抑制肽樣品凍干粉

1.3.2 酶解工藝條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計

1.3.2.1 底物質(zhì)量濃度對ACE抑制活性的影響

底物質(zhì)量濃度分別為1、3、5、7、9 g/100 mL，加酶量1%（酶與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)比）、pH 7.0、溫度55 ℃酶解3 h，測定樣品的ACE抑制率。

1.3.2.2 加酶量對ACE抑制活性的影響

加酶量分別為0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%，底物質(zhì)量濃度為7 g/mL、pH 7.0、溫度55 ℃酶解3 h，測定樣品的ACE抑制率。

1.3.2.3 pH值對ACE抑制活性的影響

pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，底物質(zhì)量濃度為7 g/mL、加酶量1%、溫度55 ℃酶解3 h，測定樣品的ACE抑制率。

1.3.2.4 酶解時間對ACE抑制活性的影響

酶解時間分別為1、3、5、7、9 h，底物質(zhì)量濃度為7 g/mL、加酶量1%、pH 7.0、酶解溫度55 ℃，測定肽樣的ACE抑制率。

1.3.2.5 酶解溫度對ACE抑制活性的影響

酶解溫度分別為45、50、55、60、65 ℃，底物質(zhì)量濃度為7 g/mL、加酶量1%、pH 7.0、酶解3 h，測定肽樣的ACE抑制率。

1.3.3 酶解工藝條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，選擇對ACE抑制率有影響的4 個因素：底物質(zhì)量濃度、pH值、酶解時間、酶解溫度，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以ACE抑制率作為響應(yīng)變量。

1.3.4 ACE 抑制率的測定

參照Shalaby等[30]的方法，稍作改動。以FAPGG作為底物，在酶標(biāo)儀上測定。

ACE溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，將1 mL蒸餾水緩緩注入單位為0.25 U的ACE的玻璃瓶中，混合均勻，待用。具體方法如下：將10 μL的ACE水溶液（0.25 U/mL）和10 μL ACE抑制肽（10 mg/mL）樣液加入酶標(biāo)板中暫不混合，然后加入150 μL經(jīng)過預(yù)熱（37 ℃、5 min）的底物（1.0 mmol/L FAPGG溶解于50 mmol/L的Tris-HCl，pH 7.5，其中包含0.3 mol/L NaCl）使其開始反應(yīng)。迅速將微孔板放入酶標(biāo)儀中，記錄在340 nm下的吸光度A1，在反應(yīng)30 min后再次測定在340 nm下的吸光度A2?？瞻讓φ帐褂?0 μL的緩沖液（50 mmol/L的Tris-HCl，pH 7.5，包含 0.3 mol/L NaCl）代替ACE抑制肽樣液，空白的起始吸光度記為A01、反應(yīng)后的記為A02。以吸光度的變化（△A抑制劑= A1-A2，△A空白= A01-A02） 計算ACE抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為經(jīng)過3 次平行實(shí)驗(yàn)得到的平均值，響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件繪圖并作方差和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 底物質(zhì)量濃度對ACE抑制率的影響

圖1 底物質(zhì)量濃度對ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity

由圖1可知，底物質(zhì)量濃度的在1～7 g/100 mL范圍內(nèi)，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，ACE抑制率逐漸升高，在7 g/100 mL時達(dá)到最大58.35%，之后隨著底物質(zhì)量濃度增加而降低。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度較小時，反應(yīng)底物與酶的結(jié)合部位濃度較低，導(dǎo)致ACE抑制率較低；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度過高時，酶解體系變得黏稠，酶被底物所飽和，ACE抑制率下降。

2.1.2 加酶量對ACE抑制率的影響

圖2 加酶量對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on ACE inhibitory activity

由圖2可知，加酶量在0.2%～1.8%范圍內(nèi)對ACE抑制率影響效果不明顯，可能是選擇的加酶量范圍并不會對ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)或成分產(chǎn)生重大影響所致。因此，在響應(yīng)面設(shè)計中確定加酶量為1%，不考慮加酶量的變化對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。

2.1.3 pH值對ACE抑制率的影響

圖3 pH值對ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on ACE inhibitory activity

由圖3可知，pH值對ACE抑制率有著很大的影響。pH 5～7范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，ACE抑制率逐漸升高，在pH 7時達(dá)到最高為57.47%，這是因?yàn)樵谒嵝曰驂A性條件下，黃粉蟲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，從而影響了酶解的效果。

2.1.4 酶解時間對ACE抑制率的影響

圖4 酶解時間對ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on ACE inhibitory activity

由圖4可知，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率隨著時間的增長呈先升后降的趨勢，這是由于在酶解的初期，酶解反應(yīng)不完全，具有抑制ACE作用的多肽片段沒有完全酶解出來。隨著時間的延長，反應(yīng)越來越充分，ACE抑制率逐漸升高，但是長時間的酶解會將多肽水解變?yōu)闆]有ACE抑制活性的氨基酸，所以ACE抑制率在7 h以后出現(xiàn)下降趨勢?？紤]到生產(chǎn)成本與效率，選擇5 h作為響應(yīng)面的時間因素的中心值。

2.1.5 酶解溫度對ACE抑制率的影響

圖5 酶解溫度對ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

由圖5可知，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率在50 ℃左右達(dá)到最大值，在低于50 ℃時，酶解溫度的上升加快了酶促反應(yīng)的進(jìn)行；而溫度高于50 ℃后，木瓜蛋白酶會隨著溫度的升高而活性減弱。因此選擇50 ℃為響應(yīng)面溫度因素的中心值。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

表1 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件的試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table1 Experimental design and results for responses surface analysis

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Analysis of variance for ACE inhibitory activity

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表1，由表2方差分析可知，模型P值顯著，失擬項P=0.064 6＞0.05，不顯著。說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果影響小。R2=0.998 2，說明該模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小。其二次方程為：Y=53.74+0.77A+ 1.75B+1.52C+4.68D-0.17AB-3.03AC+1.52AD-2.22BC-2.56BD+3.62CD-3.62A2-3.00B2-1.27C2-3.60D2。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

圖6 各因素交互影響ACE抑制活性的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effects of hydrolysis conditions on ACE inhibitory activity

由圖6可知，響應(yīng)值的變化是復(fù)雜的二次關(guān)系，任意兩個因素間均存在著明顯的交互作用。

模型優(yōu)化的最佳酶解條件為：底物質(zhì)量濃度6.82 g/100 mL、pH 6.5、時間7 h、溫度55 ℃。在此條件下，木瓜蛋白酶酶解黃粉蟲多肽產(chǎn)物的ACE抑制率模型值為59.48%。采用優(yōu)化的條件對黃粉蟲蛋白粉進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為方便操作，條件設(shè)為底物質(zhì)量濃度7 g/100 mL、加酶量1%、pH 6.5、時間7 h、溫度55 ℃。這一條件下得到黃粉蟲蛋白粉酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為58.86%，模型值與實(shí)驗(yàn)值相對偏差為1.1%，說明利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的黃粉蟲蛋白粉的酶解工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，利用本實(shí)驗(yàn)建立的模型在實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測是可行的。

3 結(jié) 論

木瓜蛋白酶酶解黃粉蟲蛋白粉制備ACE抑制肽的最優(yōu)工藝參數(shù)：底物質(zhì)量濃度7 g/100 mL、加酶量1%、pH 6.5、時間7 h、溫度 55 ℃。此時獲得的酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高，達(dá)58.86%。該方法制備的ACE抑制肽具有較高的活性，其ACE抑制率在已知的通過動物蛋白制備出的ACE抑制肽屬于中上水平。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明此模型具有較好的預(yù)測能力。研究成果對于進(jìn)一步分離純化黃粉蟲ACE抑制肽和研究其理化指標(biāo)具有重要的參考價值。

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Optimization of Preparation of Angiotensin-I Converting Enzyme Inhibitory Peptides Derived from Terebrio molitor L. Protein by Response Surface Methodology

CUI Nan, TAO Xiao-yun, LI Juan, CHEN Jian, ZHAO Li-yi, SUN Ai-dong*
(Beijing Key Laboratory of Forestry Food Processing and Safety, College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

In this study, Tenebrio molitor protein powder was hydrolyzed by papain to prepare angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides. Single factor design (involving temperature, pH, substrate concentration, enzyme dosage and hydrolysis time) and response surface methodology were used to determine the optimal hydrolysis conditions for preparing ACE inhibitory peptides. ACE inhibitory rates of hydrolysates were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The optimum conditions were determined as follows: substrate concentration 7 g/100 mL, enzyme dosage 1%, pH 6.5, hydrolysis time 7 h and temperature 55 ℃. The ACE inhibitory rate obtained under these conditions was 58.86%.

Tenebrio molitor protein powder; papain; ACE inhibitory peptides; hydrolysis conditions

TS218

A

1002-6630（2014）15-0156-05

10.7506/spkx1002-6630-201415032

2013-10-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102206）

崔楠（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：cn1867@126.com

*通信作者：孫愛東（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物生理活性物質(zhì)的開發(fā)與利用。E-mail：adsun68@163.com