腸球菌素的分離提取及其在牛乳殺菌中的應(yīng)用

都立輝，施榮華，張 虹，鞠興榮

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210023）

腸球菌素的分離提取及其在牛乳殺菌中的應(yīng)用

都立輝，施榮華，張 虹，鞠興榮

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210023）

從發(fā)酵奶酪制品中分離出1 株耐久腸球菌（Enterococcus durans）41D，其培養(yǎng)過程中產(chǎn)生能抑制李斯特菌生長的腸球菌素。本實驗通過pH值吸附法將該腸球菌素分離提純，產(chǎn)率約為45.7%。并進一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在牛乳中添加終濃度為256 AU/mL的腸球菌素時，不同的處理方式（高溫殺菌，巴氏殺菌）不影響實驗期間（15 d）腸球菌素抑菌活性的發(fā)揮。該腸球菌素在牛乳中應(yīng)用時能夠有效抑制單增李斯特菌的生長并對牛乳有較好的保存效果。

腸球菌素；分離；提純；應(yīng)用

細菌素是一類由細菌產(chǎn)生的具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽，多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均可產(chǎn)生此類物質(zhì)[1]，其對目標(biāo)細菌的抑制具有低濃度和高效性的特點[2]。目前的分類方法將乳酸菌細菌素分為兩類[3]：Ⅰ類羊 毛硫細菌素[4]和Ⅱ類不含羊毛硫細菌素（包括小分子熱穩(wěn)定多肽以及大分子熱不穩(wěn)定細菌素）。其中Ⅱ類細菌素進一步細分為4 個亞類[5-6]，分別為Ⅱa亞類（類片球菌素），具有抑制李斯特菌屬細菌生長的活性；Ⅱb亞類（雙肽細菌素）；Ⅱc亞類（環(huán)形細菌素）和Ⅱd亞類（非片球菌素線性細菌素）。食品級微生物來源的細菌素作為生物防腐劑的應(yīng)用符合消費者對于安全、健康和天然的要求。自從乳酸鏈球菌素（Nisin）通過世界糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）認(rèn)證，獲得首次商業(yè)應(yīng)用以來[7-8]，細菌素的研究一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點[9-10]。

牛乳是一種營養(yǎng)豐富而全面、含有多種人體所需維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分的全價食品。據(jù)報道，中國乳業(yè)的發(fā)展極為迅猛，過去5 年間牛乳的消費量平均增長了15%，其中液態(tài)奶的平均增長率為30%左右。所以，牛乳作為一種適合于各種人群、有著廣泛消費群體的大眾食品，正越來越受到消費者的重視。由于牛乳的營養(yǎng)成分豐富而全面，所以它也成為容易被微生物利用的一種天然培養(yǎng)基，很多食品腐敗菌和病原菌都能在其中生長，使鮮乳及其產(chǎn)品的保存期限大為縮短，質(zhì)量受到影響[11]。

李斯特菌在環(huán)境中無處不在，尤其肉類、蛋類、禽類、乳制品、蔬菜是其良好的宿主。該菌適應(yīng)能力很強，在4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖[12]，且通常的熱加工處理不能使之滅活。該菌屬中的單核細胞增生李斯特菌是一種危害性嚴(yán)重的病原菌，由它引起的李斯特菌病致死率超過25%[13-14]。

因此抑制李斯特菌的生長，對控制其對食品的污染，確保食品質(zhì)量安全具有至關(guān)重要的意義。本實驗著眼于從發(fā)酵乳制品中分離出的一株耐久腸球菌所產(chǎn)生的新型細菌素，前期研究證實該細菌素屬于Ⅱa亞類細菌素，具有較強的抑制李斯特菌活性[15-16]。本實驗通過對其分離純化方法以及其在乳制品中的應(yīng)用進行研究，以期為未來新型的天然食品防腐劑開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

耐久腸球菌41D，由美國農(nóng)業(yè)部東部研究中心饋贈，本實驗室保存；單增李斯特菌 江蘇省疾病預(yù)防控制中心饋贈；牛乳 市售。

TYL培養(yǎng)液：胰蛋白胨3%、酵母粉1%、牛肉膏0.5%、K2HPO40.5%，用磷酸調(diào)節(jié)pH值到6.5。

J-26XP落地式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；高溫滅菌鍋 上海申安醫(yī)療儀器廠；隔水式恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；大孔樹脂 美國Sigma公司；腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI） 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；異丙醇 天津科密歐試劑有限公司；其他試劑為分析純。

1.2 TYL培養(yǎng)基的預(yù)處理

按配方配制TYL液體培養(yǎng)基，使用經(jīng)70%、pH 2.0的異丙醇漂洗并經(jīng)超純水平衡的大孔吸附樹脂，除去TYL液體培養(yǎng)基中可能與之吸附的雜質(zhì)。然后再分裝3 瓶每瓶300 mL，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌后備用。

1.3 菌株的活化與培養(yǎng)

按1%初始接種量接種保存在-70 ℃的含有10%甘油的腸球菌41D菌株于TYL培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧過夜培養(yǎng)用以活化腸球菌。然后再以1%的接種量將活化的腸球菌轉(zhuǎn)接于3 瓶300 mL的TYL培養(yǎng)基中，在隔水式恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。

1.4 腸球菌素的吸附法分離提取與純化

參照文獻[17-19]的方法，本研究中腸球菌素的吸附法分離純化過程如下：將培養(yǎng)18 h后的腸球菌發(fā)酵液收集，4 ℃、12 000 r/min離心20 min取上清液，再通過以70%、pH 2.0的異丙醇漂洗并經(jīng)超純水平衡的大孔樹脂，使細菌素吸附在大孔樹脂上，之后用500 mL、70%、pH 2.0的異丙醇洗脫細菌素。同時用100 mL、70%、pH 2.0的異丙醇重新懸浮菌體沉淀，洗滌黏附在腸球菌上的細菌素，4 ℃、12 000 r/min離心20 min取上清。合并兩次洗脫液后以75 ℃恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至25 mL，通過1 000 D的透析袋透析過夜。再次75 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至25 mL。

1.5 腸球菌素的活性和效價的測定

以單增李斯特菌作為指示菌，從旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的25 mL腸球菌素中取100 μL進行2 倍稀釋（在EP管中加入100 μL的超純水，然后取100 μL腸球菌素加入超純水中，混勻后逐級向下稀釋），取稀釋好的細菌素溶液5 μL，滴加到接種體積分?jǐn)?shù)0.5%新鮮的單增李斯特菌的BHI固體培養(yǎng)基上，通過瓊脂擴散法檢測該梯度細菌素稀釋液的抑菌效果。用有抑菌效果的最高稀釋倍數(shù)表示腸球菌素的效價。為了確定分離純化效果，取培養(yǎng)18 h時的菌液1 mL，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min取上清按上述同樣方法測定提純前的細菌素效價，并計算其細菌素的得率。

腸球菌素的活性/（AU/mL）=2n×（1 000/5） （1）

式中：n為對單增李斯特菌有抑菌效果的最大稀釋倍數(shù)。

1.6 不同殺菌方式對腸球菌素抑菌活性的影響

取100 μL的腸球菌素加入裝有5 mL牛乳的試管中（終濃度為256 AU/mL），對其分別進行巴氏殺菌（70 ℃水浴，30 min）和高溫高壓滅菌（121 ℃，15 min）處理，冷卻至室溫后再加入0.1%的李斯特菌，分別于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、5、7、9、10、15 d，然后進行10 倍稀釋，取100 μL在BHI固體培養(yǎng)基上涂布，檢測牛乳樣品中的李斯特菌數(shù)量，同時與未進行滅菌處理的樣品進行對比。

1.7 不同腸球菌素添加量對其抑制單增李斯特菌的影響

分別取0、100、200、500 μL腸球菌素添加于5 mL的牛乳中巴氏殺菌后再向其中加入0.1%的單增李斯特菌，混勻后分別放入4 ℃和25 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，然后在培養(yǎng)1、3、5、7、9、10、15 d后，取樣檢測樣品中的單增李斯特菌菌數(shù)。

1.8 不同添加量的腸球菌素在牛乳中的穩(wěn)定性

分別添加100、200、500 μL的腸球菌素（終濃度分別為：256、512、1 280 AU/mL），于5 mL的牛乳中，將其分別放入4 ℃和25 ℃培養(yǎng)箱中孵育。然后在第1、3、5、7、9、15天取100 μL進行2 倍稀釋，取稀釋液5 μL，垂直滴加在接種有0.5%新鮮的單增李斯特菌的BHI固體培養(yǎng)基上，檢測其抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸球菌素的效價分析與分離純化結(jié)果

表1 細菌素的提取純化結(jié)果Table 1 Extraction and purification of the bacteriocin

細菌素的效價測定采用2 倍稀釋法，在一定濃度范圍內(nèi)，根據(jù)抑菌圈的個數(shù)能粗略地表示出細菌素的濃度[20]。從發(fā)酵液中提取和純化的細菌素結(jié)果見表1。通過吸附法分離純化后的細菌素的總活有所降低，但效價顯著提高，幾乎是未分離純化前的15 倍，得率為45.7%。經(jīng)過pH值吸附法處理后其效價明顯增加，少量添加即可達到高效抑制李斯特菌生長的目的。此吸附法根據(jù)pH值沉降原理，當(dāng)pH 6.0時，大孔樹脂吸附細菌素，pH 2.0時使用異丙醇解吸附這一特性進行腸球菌素提取。此方法具有步驟少，成本低，回收率高的特點，與常用的硫酸銨沉淀法比較，此方法重現(xiàn)性好，雜質(zhì)少[21]。與離子交換柱層析，凝膠過濾層析相比，此吸附法有步驟少，成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)的特點。

2.2 不同殺菌方式對腸球菌素抑菌活性的影響

將100 μL的腸球菌素加入到5 mL牛乳中（終濃度為256 AU/mL），現(xiàn)階段牛乳的處理方式主要是巴氏殺菌和高溫高壓殺菌法。故本實驗考察了這兩種方式對腸球菌素的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同殺菌方式對腸球菌素抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different heat treatments on the inhibitory activity of the bacteriocin

由圖1可知，使用巴氏殺菌和高溫高壓殺菌對腸球菌素處理后與未經(jīng)處理的對照相比，其抑制單增李斯特菌的效果幾乎沒有影響。這一結(jié)果說明本實驗提取的腸球菌素穩(wěn)定性好，經(jīng)過常規(guī)的處理后沒有影響。本實驗用到的腸球菌素含有43 個氨基酸殘基，分子質(zhì)量較小，約5 kD，含有2 個半胱氨酸（Cys）殘基，可能形成1 對分子內(nèi)的二硫鍵。半胱氨酸以二硫鍵的形式存在不僅可能對腸球菌素的活性產(chǎn)生影響，而且二硫鍵還賦予它很高的熱穩(wěn)定性[22-23]，因此本腸球菌素具有成為熱加工食品添加劑的巨大潛力。

2.3 不同腸球菌素添加量對其抑制單增李斯特菌的影響

向牛乳中加入不同量的腸球菌素后，在4 ℃和25 ℃條件下，其抑制單增李斯特菌生長的情況見圖2，無論在4 ℃還是25 ℃條件下，加入腸球菌素后單增李斯特菌的數(shù)量均明顯減少，且隨著腸球菌素添加量的增加，單增李斯特菌的數(shù)目減少得更加劇烈。4 ℃的牛乳中的李斯特菌的數(shù)量顯著低于25 ℃的情況。在4 ℃時，當(dāng)腸球菌素添加量為500 μL時（終濃度1 280 AU/mL），其中添加的單增李斯特菌被完全抑制，在整個實驗周期各檢測時間的活菌數(shù)均為0。由此可見，腸球菌素在牛乳中能夠抑制李斯特菌的生長，并且隨著腸球菌素添加量的增加其抑制效果越好。

圖2 不同腸球菌素添加量在25 ℃（A）和4 ℃（B）條件下對其抑制單增李斯特菌的影響Fig.2 Inhibitory effects on Listeria monocytogenes of different amounts of the bacteriocin at 25 ℃ (A) and 4 ℃ (B)

2.4 不同添加量的腸球菌素在牛乳中的穩(wěn)定性

表2 不同溫度和添加量對腸球菌素在牛乳中穩(wěn)定性的影響Table 2 Stability of the bacteriocin as a function of temperature and concentraattiioonn AU/mL

在牛乳中加入不同量的腸球菌素后，在不同溫度下的保存效果如表2所示，經(jīng)過15 d后，不同添加量的腸球菌素在牛乳中的效價基本沒有變化。說明本腸球菌素在牛乳中有良好的保存效果，穩(wěn)定性較好。

3 結(jié) 論

3.1 本實驗采用的吸附法分離提取腸球菌素具有重現(xiàn)性好，產(chǎn)品雜質(zhì)少的優(yōu)點。通過吸附法分離純化后的細菌素的總活力有所降低，但效價顯著提高，幾乎是未分離前的15 倍，細菌素得率為45.7%。

3.2 提取純化的腸球菌素加入牛乳后，巴氏殺菌和高溫高壓殺菌都不影響該腸球菌素抑制單增李斯特菌生長的效果，并且在整個實驗周期內(nèi)，腸球菌素的效價沒有變化。無論在4 ℃還是25 ℃條件下，腸球菌素均能抑制牛乳中單增李斯特菌的生長，且隨著添加量的增加其抑菌效果也增加。值得指出的是：在4 ℃時，向牛乳中加入本實驗提取的500 μL腸球菌素（終濃度1 280 AU/mL）能完全抑制單增李斯特菌的生長。

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Purification of the Bacteriocin Produced by Enterococcus durans and Its Application in Milk Sterilization

DU Li-hui, SHI Rong-hua, ZHANG Hong, JU Xing-rong
(Jiangsu Key Laboratory of Quality Control and Further Processing of Cereals and Oils, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

One Enterococcus durans strain designated 41D was isolated from fermented cheese products. The strain produced bacteriocin that can inhibit the growth of Listeria monocytogenes. In this study, a pH absorption method was used to separate and purify the bacteriocin with a yield of about 45.7%. Further investigation suggested that when the bacteriocin was added into milk samples at a final concentration of 256 AU/mL, its antibacterial activity was not affected by different treatments including high-temperature sterilization and pasteurization during the experiment period. When applied in milk, the bacteriocin could effectively inhibit the growth of Listeria monocytogenes. These results have provided the basis for the development of new natural food preservatives using this bacteriocin.

bacteriocin; absorption; purif i cation; application

TS201.6

A

1002-6630（2014）15-0001-04

10.7506/spkx1002-6630-201415001

2013-07-19

國家自然科學(xué)基金面上項目（31271930）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31101338）；

江蘇省高校自然科學(xué)基金面上項目（11KJB550002）

都立輝（1981—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：ddabc_2000@163.com