大黃魚(Pseudosciaena crocea)內(nèi)臟白點病病原分離鑒定及致病性研究*

胡 嬌 張 飛 徐曉津 蘇永全 覃映雪 馬 英張 藝 韓坤煌 鄢慶枇①

(1.集美大學水產(chǎn)學院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室 廈門 361021;2.廈門大學海洋與地球學院 廈門 361005;3.寧德市水產(chǎn)技術推廣站 寧德 352101;4.寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司 寧德 352103)

大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國單一品種養(yǎng)殖量最大的海水魚類,被農(nóng)業(yè)部確定為我國六種最具優(yōu)勢出口水產(chǎn)品之一(陳強等,2007)。目前隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,各種病害的發(fā)生也日趨頻繁,新的病害種類也屢有發(fā)生。大黃魚的內(nèi)臟白點病是近幾年網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚的常見病害,2013年春季該病發(fā)生率和死亡率再創(chuàng)新高,給閩東地區(qū)大黃魚養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。

近年來的 1—4月為大黃魚內(nèi)臟白點病高發(fā)季節(jié),海區(qū)水溫超過20°C后該病就自然消退。病魚體表無明顯癥狀,解剖可見肝、脾、腎等內(nèi)臟有0.5—3mm大小不等的白色結節(jié),故稱此病為內(nèi)臟白點病。王國良等(2006)報道從患內(nèi)臟白點病的大黃魚魚體內(nèi)分離到魚諾卡氏菌(Nocardia seriolea)。沈錦玉等(2008)和邱楊玉等(2012)認為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)是引起大黃魚內(nèi)臟出現(xiàn)白點的病原。本文首次采用生態(tài)模擬的方式從患病內(nèi)臟白點病大黃魚體內(nèi)分離病原并進行其致病性研究,以期增進對養(yǎng)殖大黃魚內(nèi)臟白點病的認識并為疾病的防治提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

患內(nèi)臟白點病大黃魚取自寧德市富發(fā)公司大黃魚養(yǎng)殖漁排,體重100g左右。

健康大黃魚取自寧德市富發(fā)公司大灣漁排,體重150g左右。

1.2 病原菌的分離純化

無菌操作從病魚肝臟、脾和腎臟組織中取樣,劃線接種于TSA平板上,18°C培養(yǎng)24h。挑取優(yōu)勢菌落若干個和其它特征菌落進行劃線分離三次,將純化的菌落接種于TSA斜面18°C培養(yǎng)24h后用20%甘油生理鹽水洗脫,–80°C低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 回歸感染實驗

選擇從脾臟分離的2株優(yōu)勢菌和4株非優(yōu)勢菌進行人工感染實驗。實驗共設6個實驗組和1個對照組,每組各10尾大黃魚,在1噸的養(yǎng)殖桶中暫養(yǎng)3d后開始實驗。細菌18°C培養(yǎng)24h后用生理鹽水制成菌懸液,實驗組大黃魚每尾背部肌肉注射0.2mL菌懸液,濃度為103cfu/g魚體重,對照組大黃魚每尾注射0.2mL無菌生理鹽水。注射后繼續(xù)飼養(yǎng) 7d,每天觀察 3次,記錄各組的死亡情況。死魚及時撈起,解剖觀察內(nèi)臟是否有白色結節(jié)。整個感染過程的水溫為16—19°C。

選擇從脾臟分離的 1株優(yōu)勢菌,實驗共設 3個實驗組和3個對照組,感染過程的水溫為7—10°C、16—19°C 和 24—27°C,對照組大黃魚每尾注射0.2mL無菌生理鹽水,其它實驗條件同上。

選擇從脾臟分離的1株優(yōu)勢菌,實驗共設6個實驗組和1個對照組,感染濃度10、102、103、104、105和106cfu/g魚體重,對照組大黃魚每尾注射0.2mL無菌生理鹽水,整個感染過程的水溫為 16—19°C,其它實驗條件同上。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 飛行時間質譜微生物鑒定儀分析 挑取適量菌落樣品,加入無水乙醇固定滅活 3min,10000r/min高速離心去上清。先后加入70%甲酸和乙腈,仔細混勻室溫放置3min,10000r/min高速離心,吸取上清點靶,使用Microflex LRF20飛行時間質譜微生物鑒定儀進行鑒定。

1.4.2 病原菌16S rDNA基因的測定 使用 E.Z.N.A BacterialDNA Kit(購自Omega公司)提取菌株NZBD9和NZBD11基因組DNA。設計2條引物(由上海英俊生物技術有限公司合成),27F:5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’,1492R:5’-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3’。25μL PCR 擴增體系:模板 1μL,引物各 0.5μL,Mg2+2μL,DNTP 2μL,10×Buffer 2.5μL,Taq酶0.2μL,去離子水15.3μL。擴增條件:預變性94°C、5min;變性 94°C、50s;退火 54°C、50s;延伸72°C、90s;然后回到變性溫度 30個循環(huán);保溫 72°C、10min。1%瓊脂糖凝膠100mA,110V,電泳20min判定 PCR擴增結果。PCR產(chǎn)物回收純化:用 E.Z.N.A GelExtraction Kit(購自Omega公司)回收純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物送華大基因進行基因測序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

病原菌的16S rDNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast/)進行序列同源性分析,并使用 ClustalX 1.83軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進行多序列匹配排列,采用鄰接法獲得系統(tǒng)發(fā)育樹,并通過 Bootstrap法(1000次重復)檢驗。

1.6 藥物敏感實驗

采用紙片擴散法。致病菌于 TSA斜面 18°C培養(yǎng)24h后用無菌生理鹽水洗脫制成濃度約為10×108cfu/mL菌懸液,取 0.1mL菌懸液分別涂布于TSA平板,10min后貼上不同的藥物紙片(購自杭州天和微生物試劑公司),于 18°C培養(yǎng) 24h 后測量抑菌圈直徑。

1.7 病理組織切片的制作及觀察

分別取對照組和有典型病癥大黃魚的頭腎和肝組織,用 Bouin氏液固定,石蠟包埋。通過 Leica RM2128型切片機橫、縱向連續(xù)切片(厚3—5μm),于Leica AUTOSTAINER XL染色機中進行H.E染色,中性樹膠封片。Leica DM 4500B自動數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)觀察、攝影。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

通過平板劃線分離純化共得到 16株候選菌,編號依次為NZBD1—NZBD16,其中優(yōu)勢菌有NZBD1、NZBD9、NZBD11、NZBD14和 NZBD15。18°C培養(yǎng)48h后,菌株NZBD9和NZBD11在TSA瓊脂平板上形成為直徑1—2mm、白色、表面光滑濕潤、邊緣光滑的圓形菌落。

2.2 人工感染

養(yǎng)殖水體16—19°C條件下回歸感染實驗結果如表1所示。6個實驗組,只有NZBD9和NZBD11感染組的實驗魚出現(xiàn)死亡,NZBD9和 NZBD11是優(yōu)勢菌株,且致病性強,所以 NZBD9和 NZBD11為導致養(yǎng)殖魚死亡的致病菌。

表1 6株分離菌人工感染結果Tab.1 The results of artificial infection of 6 isolations

對菌株NZBD9的進一步人工感染實驗結果如表2所示。在10 cfu/g的濃度下,實驗魚無死亡;在102cfu/g的濃度下,開始出現(xiàn)死亡;1×105cfu/g的濃度下實驗魚的死亡率為 100%;對照組的實驗魚無死亡。

對菌株NZBD9在3個溫度下的進一步人工感染實驗結果如表3所示。在7—10°C和24—27°C水體條件下,實驗魚無死亡;在16—19°C水體條件下,死亡率達50%;對照組的實驗魚無死亡。

表2 菌株NZBD9人工感染結果Tab.2 The results of artificial infection of strain NZBD9

表3 不同溫度下菌株NZBD9人工感染結果Tab.3 The results of artificial infection of strain NZBD9 under different temperatures

如圖1所示,感染致病菌的大黃魚腎臟、脾臟出現(xiàn)直徑 0.4—1.0mm的白點,嚴重的病魚肝也會出現(xiàn)白點。從實驗死亡魚分離得到與菌株 NZBD9和NZBD11相同的菌落。

圖1 大黃魚內(nèi)臟白點病病征Fig.1 Symptoms of internal organs white-spots disease of P.crocea

2.3 16S rDNA基因檢測結果

菌株NZBD9和NZBD11的16S rDNA基因檢測結果如圖2。2個菌株的16S rDNA基因的長度同為1459bp,而且序列相同,可鑒定為同一菌株。

2.4 時間飛行質譜微生物鑒定儀分析結果

菌株NZBD9和NZBD11在高通量微生物鑒定儀下分析結果如圖3、圖4、圖5。實驗結果表明,菌株NZBD9和NZBD11同為變形假單胞菌。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

Blast結果發(fā)現(xiàn) 2株致病菌與變形假單胞菌 16S rDNA的同源性達到 100%,從構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中可見 NZBD9菌株與變形假單胞菌聚為一支,說明NZBD9菌株與變形假單胞菌親緣關系最近,可將其鑒定為變形假單胞菌。系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示。

2.6 藥敏實驗結果

菌株NZBD9對19種抗生素紙片的敏感性測試結果見表4。結果顯示,9菌株對慶大霉素、諾氟沙星、多粘霉素B、依諾沙星、四環(huán)素、卡那霉素、鏈霉素、強力霉素、新霉素、新生霉素和氧氟沙星 11種藥物敏感;對青霉素、復合磺胺、萬古霉素、利福平、紅霉素、呋喃唑酮、氯霉素和呋喃妥因 8種藥物有抗性。

圖2 菌株NZBD9和NZBD11的16S rDNA基因序列Fig.2 Sequence of 16S rDNA genes of strain NZBD9 and NZBD11

圖3 時間飛行質譜鑒定儀對NZBD9和NZBD11的鑒定結果Fig.3 Results of strain NZBD9 and NZBD11 identified by Time of Flight Mass Spectrometer

2.7 石蠟組織切片觀察

2.7.1 腎臟 健康大黃魚的腎臟各細胞結構完整,質地均勻,腎小管由單層上皮細胞構成,上皮細胞排列緊湊,上皮細胞間界限清晰(圖7a)。感染變形假單胞菌后,腎小管形狀較不規(guī)則,腎小管上皮細胞腫脹,排列較紊亂(圖7c),管腔變窄或閉塞;較嚴重區(qū)域腎小管完全失去原來的組織結構,解體后形成大面積的壞死灶,壞死灶中心區(qū)充滿解體后的細胞碎片(圖7b)。

圖4 時間飛行質譜鑒定儀對NZBD9的具體鑒定結果Fig.4 Results in detail of strain NZBD9 identified by Time of Flight Mass Spectrometer

圖5 時間飛行質譜鑒定儀對菌株NZBD11的具體鑒定結果Fig.5 Results in detail of strain NZBD11 identified by Time of Flight Mass Spectrometer

圖6 NZBD9菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain NZBD9

2.7.2 脾組織 健康大黃魚的脾臟由結締組織網(wǎng)、毛細血管網(wǎng)和間于其中的細胞群組成。細胞的組成有紅血球形成細胞、未成熟紅血球、成熟紅血球、淋巴球、單核球、吞噬細胞等,這些細胞密集相間,其中淋巴細胞可聚集形成淋巴島(圖7d)。大黃魚受變形假單胞菌感染后,脾臟組織惡化、充血,壞死較嚴重(圖7e);脾組織吞噬一定量菌體后,髓竇內(nèi)堆積大量含鐵血黃素,髓竇周圍出現(xiàn)許多空泡(圖7f)。

2.7.3 肝組織 健康大黃魚肝組織結構清晰,細胞形狀比較規(guī)則,是略帶圓形的多角形細胞,排列較均勻規(guī)則,具有球形并帶有一個核仁的細胞核,細胞核圓形,位于細胞的中間;細胞質中含有豐富的脂肪和糖原,在石蠟切片中,通過 H.E染色后,常常呈現(xiàn)許多空泡樣結構(圖7g)?；疾◆~部分肝細胞壞死嚴重,細胞萎縮,排列疏松,肝細胞界限模糊不清,空隙較明顯(圖7h);許多肝細胞實質結構遭到破壞,干細胞崩解,呈現(xiàn)空泡化(圖7h和圖7i)。

圖7 患病大黃魚腎臟、脾臟、肝臟組織病變Fig.7 Pathological changes of kidney,spleen and liver tissues of diseased P.crocea

表4 菌株NZBD9的藥敏性實驗結果Tab.4 Results of antibiotic sensitivity test of strain NZBD9

3 討論

內(nèi)臟白點病是養(yǎng)殖大黃魚的常見病,多發(fā)生在水溫較低的春節(jié)。內(nèi)臟白點病已危害養(yǎng)殖大黃魚多年,且危害逐年嚴重。近年來,許多學者對大黃魚內(nèi)臟白點病的病原進行了研究,但目前尚未有統(tǒng)一的定論。王國良等(2006)認為大黃魚內(nèi)臟白點病的病原是諾卡氏菌(Wanget al,2005),劉家富等(2004)認為大黃魚內(nèi)臟白點病的病原是門多薩假單胞菌和銅綠假單胞菌,而劉振勇等(2002)認為大黃魚內(nèi)臟白點病的病原僅有門多薩假單胞菌。沈錦玉等(2008)和邱楊玉等(2012)認為大黃魚內(nèi)臟白點病的病原是惡臭假單胞菌,Blanco 等(2002)、López-Romalde 等(2003)和 Balboa等(2007)認為大黃魚內(nèi)臟白點病的病原是熒光假單胞菌。本文從患內(nèi)臟白點病大黃魚的內(nèi)臟分離到多株細菌,在進行人工感染的6個分離株中只有2株對大黃魚有致病性,其它4株都不致病,而且致病的2株分離株同為變形假單胞菌,這說明寧德大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌為變形假單胞菌。本文從病原分離至人工感染全程模擬自然發(fā)病的水溫,分離得到有很強致病性的變形假單胞菌。該菌不僅發(fā)病的癥狀與自然發(fā)病的內(nèi)臟白點病一致,發(fā)病的水溫要求也與自然發(fā)病的水溫一致,這進一步證實變形假單胞菌為寧德養(yǎng)殖大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌。

變形假單胞菌是自然環(huán)境中的常見菌,對多種污染物有較強的分解能力,常被用于污水處理(陳亞麗等,2002;曹軍偉等,2011)。水產(chǎn)養(yǎng)殖較為常見的致病菌。變形假單胞菌引起水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病也有所報道。這種細菌曾在帶有細菌性出血性腹水的養(yǎng)殖香魚上分離得到(Nishimoriet al,2000)。由變形假單胞菌引起的香魚細菌性出血性腹水病經(jīng)常在引入自然或人工產(chǎn)的魚苗到養(yǎng)殖池中后短時間內(nèi)暴發(fā),并且在養(yǎng)殖時期的任何階段都可能暴發(fā)(Seet al,2000)。病原菌變形假單胞菌是一種條件致病菌,但是肌肉注射感染實驗表明其對香魚有極高的毒力,半致死劑量(LD50)為101.2cfu/fish。變形假單胞菌能夠在飼養(yǎng)香魚的淡水水體中生長和繁殖(Seet al,2000),變形假單胞菌通過擴散在香魚養(yǎng)殖水體中,從而迅速水平傳播這種疾病。

本文所分離的變形假單胞菌在 28°C生長良好,而大黃魚內(nèi)臟白點病僅見于水溫 20°C以下,本文人工感染的結果也顯示變形假單胞菌在23—27°C水溫對大黃魚不致病,其原因可能是由于變形假單胞菌分泌的胞外產(chǎn)物在不同溫度下有所不同,也可能是由于大黃魚在低溫下抗感染免疫力低下,給變形假單胞菌以可趁之機。本文的研究結果顯示:此次從患病大黃魚上分離的變形假單胞菌對青霉素、復合磺胺、萬古霉素、利福平、紅霉素、呋喃唑酮、氯霉素和呋喃妥因等8種抗生素已經(jīng)產(chǎn)生一定的抗藥性,因此對于大黃魚內(nèi)臟白點病的防治應該主要考慮提高大黃魚的抗病免疫力。

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