參七蟲草膠囊對(duì)肺纖維化大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶－9及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑－1表達(dá)的影響

潘中良，張念志，呂園園，陳晶晶，魏姍姍，謝 勤

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽合肥 230031）

參七蟲草膠囊對(duì)肺纖維化大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶－9及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑－1表達(dá)的影響

潘中良1，張念志2，呂園園2，陳晶晶1，魏姍姍1，謝 勤1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽合肥 230031）

目的 探究參七蟲草膠囊治療肺纖維化的機(jī)制。方法 將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、潑尼松組、參七蟲草膠囊組，每組20只。采用博萊霉素氣管內(nèi)滴注法復(fù)制肺纖維化模型。給藥后15、30 d，分別觀察各組大鼠肺組織病理變化，并采用免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶－9（matrix metalloproteinases－9，MMP－9）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑－1（issue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1）的表達(dá)水平。結(jié)果 與模型組比較，參七蟲草膠囊組、潑尼松組大鼠各時(shí)點(diǎn)肺泡炎性反應(yīng)和肺纖維化程度明顯減輕，各時(shí)點(diǎn)潑尼松組、參七蟲草膠囊組肺組織MMP－9、TIMP－1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）。結(jié)論 參七蟲草膠囊抑制肺纖維化早期肺泡的炎性反應(yīng)與其降低肺組織MMP－9、TIMP－1表達(dá)水平有關(guān)。

參七蟲草膠囊；肺纖維化；基質(zhì)金屬蛋白酶；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑

肺纖維化是多種原因引起的彌慢性肺間質(zhì)疾病共同的最終結(jié)局，也是肺組織自身修復(fù)的一種病理過程。近年來，在對(duì)肺間質(zhì)纖維化的研究中，細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）的變化越來越受到關(guān)注，其合成和降解失衡是引起肺纖維化的重要病理生理因素，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是調(diào)節(jié)ECM降解的重要體系［1］。筆者旨在觀察參七蟲草膠囊對(duì)博來霉素致肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織MMP－9、TIMP－1表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步探討參七蟲草膠囊防治肺纖維化的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，共80只，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（皖）2013－004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 博萊霉素（bleocin，BLM）：每支150mg，日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)230961；參七蟲草膠囊：安徽省中醫(yī)院呼吸科院內(nèi)制劑，每粒0.4g，批號(hào)20110808；醋酸潑尼松片：浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，每片5mg，批號(hào)100102；MMP－9試劑盒：北京中杉公司，批號(hào)H4152；TIMP－1試劑盒：北京博奧森公司，批號(hào)9904228W。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制方法 將80只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、潑尼松組、模型組、參七蟲草膠囊組，每組20只。根據(jù)文獻(xiàn)［2］，先予10％水合氯醛3.5ml／kg麻醉大鼠，再經(jīng)鼻一次性向氣管內(nèi)滴注BLM 5.0mg／kg，滴注后立即將大鼠直立懸吊并前后旋轉(zhuǎn)，即可復(fù)制肺纖維化模型。

2.2 給藥方法 在模型復(fù)制24h后，治療組大鼠予以中劑量參七蟲草膠囊（每日0.35g／kg，相當(dāng)于成人劑量7倍，溶于1ml蒸餾水中）灌胃，對(duì)照組大鼠給予潑尼松（每日6.0mg／kg，相當(dāng)于成人劑量7倍，溶于1ml蒸餾水中）灌胃，模型組和空白組大鼠給予等容積生理鹽水灌胃，為期均30d。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠自由飲水和進(jìn)食。

2.3 標(biāo)本采集 給藥后15、30d，每組分別隨機(jī)取一半大鼠處死（在實(shí)驗(yàn)過程中，共有16只大鼠死亡，原因不明），取肺組織，在生理鹽水中漂洗干凈，取右肺中葉置于10％甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋處理后制成石蠟組織塊和切片，采用免疫組織化學(xué)方法測定肺組織MMP－9、TIMP－1表達(dá)水平；行蘇木精－伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，觀察肺泡炎和肺纖維化程度。

2.4 標(biāo)本檢測 ①采用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。②肺組織MMP－9和TIMP－1表達(dá)水平測定：采用免疫組織化學(xué)方法，按照MMP－9、TIMP－1試劑盒說明書檢測不同時(shí)點(diǎn)各組肺組織MMP－9、TIMP－1表達(dá)水平。以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為MMP－9和TIMP－1染色陽性反應(yīng)，著色深表示表達(dá)水平越高。陽性表達(dá)部位主要集中在支氣管上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞及中性

粒細(xì)胞。采用CIAS－1000型圖像分析儀分析切片，每張切片隨機(jī)采集5個(gè)視野（10×40倍），測量其MMP－9和TIMP染色陽性細(xì)胞的平均光密度，經(jīng)過該系統(tǒng)自動(dòng)分析獲得肺組織該視野的平均光密度值，取其平均值作為單個(gè)樣本的MMP－9、TIMP－1蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈正態(tài)分布的連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)（方差齊）或Dunnett's T3檢驗(yàn)（方差不齊）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)變化比較 空白組肺組織結(jié)構(gòu)無破壞，肺泡腔內(nèi)無炎性滲出。給藥后15d，模型組大鼠肺組織可見以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡隔增寬，支氣管附近纖維化較明顯；參七蟲草膠囊組、潑尼松組肺內(nèi)有少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡呈中度炎性反應(yīng)及輕度纖維化改變。給藥后30d，模型組大鼠肺組織可見大片團(tuán)塊狀巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔縮小，肺間質(zhì)被膠原纖維和成纖維細(xì)胞替代，肺間質(zhì)纖維化形成；參七蟲草膠囊組、潑尼松組大鼠肺纖維化程度增加，但較模型組程度為輕。見圖1。

圖1 給藥后15、30d各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)變化（HE染色，10×20倍）

3.2 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達(dá)水平比較 給藥后15、30d，與空白組比較，模型組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，潑尼松組和參七蟲草膠囊組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）；潑尼松組與參七蟲草膠囊組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1和圖2。

表1 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達(dá)水平比較（±s）

表1 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達(dá)水平比較（±s）

注：與同期空白組比較，＊＊P＜0.01；與同期模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組 別nMMP－9／10－2 OD值TIMP－1／10－2 OD值30d空 白給藥后15d給藥后30d 給藥后15d給藥后8 0.42±0.06 0.40±0.04 0.39±0.06 0.40±0.04模 型8 0.60±0.07＊＊0.54±0.03＊＊0.59±0.08＊＊0.63±0.02＊＊潑尼松8 0.52±0.02＃＃0.48±0.04＃＃0.46±0.04＃＃0.52±0.01＃＃參七蟲草膠囊8 0.52±0.06＃＃0.51±0.03＃0.45±0.04＃＃0.50±0.03＃＃

4 討論

肺纖維化的形成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，雖然其病因或原發(fā)病有很大差異，但在纖維化過程中ECM代謝異常是類似的。ECM主要由膠原、彈力纖維、糖胺多糖等組成。成肌纖維細(xì)胞在ECM的合成、積聚和重構(gòu)中起重要作用。ECM積聚異常增多是肺纖維化組織重構(gòu)混亂的標(biāo)志。纖維母細(xì)胞增生以及膠原等ECM成分過度沉積，肺泡正常的結(jié)構(gòu)就會(huì)消失。肺泡炎程度愈重，肺損傷及纖維化愈重［3］。ECM的調(diào)節(jié)紊亂主要與MMPs及TIMP有關(guān)［4］，兩者之間的失衡可能是導(dǎo)致肺組織損傷、重塑和纖維化的重要機(jī)制之一［5］。MMPs是分解ECM的主要酶類。MMP－9是降解Ⅳ型膠原的主要酶。正常肺組織中僅有少量的MMP－9，但在肺纖維化產(chǎn)生過程中，成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞等一些炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞

都可產(chǎn)生MMP－9［6］。在疾病的不同時(shí)期，MMPs的表達(dá)是不同的，在肺纖維化早期肺組織以MMP－9的活性增強(qiáng)為主，主要存在于滲出的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。這些炎性細(xì)胞釋放的MMP－9可使基底膜崩解、斷裂，致肺泡腔細(xì)支氣管化，而正是這種肺泡腔的細(xì)支氣管化，成纖維細(xì)胞的侵入和增殖，產(chǎn)生大量的ECM，導(dǎo)致肺纖維化的進(jìn)一步形成。TIMPs是MMPs功能的重要調(diào)節(jié)因素，其作用主要是抑制MMPs對(duì)ECM的降解。TIMP－1在組織中特異性地抑制MMP－9，能抑制ECM的降解。正常狀況下，肺內(nèi)ECM的合成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡，MMP－9／TIMP－1比值升高，肺損傷嚴(yán)重，以炎性反應(yīng)為主；MMP－9／TIMP－1比值降低，肺組織以修復(fù)重塑為主。其比值的變化導(dǎo)致ECM的代謝失衡可能是肺纖維化形成的重要機(jī)制。因此研究MMP－9／TIMP－1的相互作用關(guān)系對(duì)肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和治療有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖2 給藥后不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達(dá)水平比較（紅色箭頭示免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞，10×40倍）

既往研究［7］已證實(shí)冬蟲夏草具有抑制和預(yù)防肺纖維化發(fā)生的作用。目前活血化瘀法是已被認(rèn)可的治療肺纖維化的常用療法。參七蟲草膠囊是張念志治療肺間質(zhì)纖維化的經(jīng)驗(yàn)方，由西洋參、三七、冬蟲夏草3味藥物按照1∶1∶1的配伍比例組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、益肺固腎的作用。方中西洋參為君藥，輔以冬蟲夏草益肺腎之精，佐以三七活血化瘀以治標(biāo)。諸藥合用，配伍合理，標(biāo)本同治，補(bǔ)虛不留邪，祛邪不傷正。實(shí)驗(yàn)研究［8］發(fā)現(xiàn)，參七蟲草膠囊能降低肺纖維化大鼠轉(zhuǎn)化生長因子－β1mRNA的表達(dá)水平，能減輕肺纖維化的程度。

本研究結(jié)果表明，模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)肺組織MMP－9、TIMP－1表達(dá)水平顯著高于同時(shí)點(diǎn)空白組，提示MMP－9、TIMP－1參與了肺纖維化的發(fā)展。此外，各組MMP－9表達(dá)水平在給藥后30d較給藥后15d呈下降趨勢，說明MMPs活性與肺泡免疫反應(yīng)密切相關(guān)。而各組TIMP－1表達(dá)水平在給藥后30d達(dá)到最高值，提示TIMP－1表達(dá)水平持續(xù)升高可能亦與肺纖維化的形成有密切關(guān)系。因?yàn)樵诜卫w維化的早期主要是以肺損傷、肺泡炎癥為主要病理特征，后期炎性細(xì)胞減少，纖維化程度增強(qiáng)，所以在肺纖維化早期和中期MMP－9、TIMP－1均呈高表達(dá)狀態(tài)，這可能是炎癥早期未出現(xiàn)ECM積聚的重要原因之一。而到肺纖維化晚期，隨著MMP－9表達(dá)水平降

低，TIMP－1表達(dá)水平仍持續(xù)升高，同時(shí)抑制了MMP－9的活性，可能會(huì)使MMP－9／TIMP－1比值變小，平衡漸向TIMP－1傾斜，使基質(zhì)膠原酶活性下降，膠原沉積，導(dǎo)致肺組織中出現(xiàn)一個(gè)降解低下的微環(huán)境，ECM的降解減少而合成增加，導(dǎo)致膠原等ECM過度沉積，從而形成肺纖維化。參七蟲草膠囊組各時(shí)點(diǎn)肺組織MMP－9、TIMP－1表達(dá)水平均顯著低于模型組，提示參七蟲草膠囊在實(shí)驗(yàn)早期可以降低MMP－9的表達(dá)，從而減輕ECM對(duì)基底膜的損傷，在肺纖維化后期抑制肺內(nèi)TIMP－1表達(dá)，從而減少TIMP－1對(duì)MMP－9表達(dá)的抑制，促進(jìn)MMP－9對(duì)ECM的降解，使MMP－9／TIMP－1系統(tǒng)趨于平衡，從而延緩肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。參七蟲草膠囊組與潑尼松組MMP－9和TIMP－1水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示參七蟲草膠囊具有糖皮質(zhì)激素樣抑制肺間質(zhì)纖維化的作用。

綜上所述，參七蟲草膠囊能夠抑制肺纖維化大鼠肺組織的炎癥及病理變化，其作用與抑制肺組織中MMP－9與TIMP－1表達(dá)水平有關(guān)。

［1］丁明橋，許朝霞.銀杏葉提取物對(duì)肺纖維化大鼠模型肺組織MMP－9及TIMP－1表達(dá)的影響［J］.北京中醫(yī)藥，2011，30（11）：869－871.

［2］胡靜，劉旭凌.經(jīng)鼻滴入博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的建立及其病理演變［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，17（5）：351－353.

［3］張弘，夏永良，楊珺超.等.補(bǔ)肺湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織MMP－9、TIMP－1蛋白表達(dá)影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（12）：2673－2676.

［4］張華根.特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機(jī)制研究新進(jìn)展［J］.四川醫(yī)學(xué)，2009，30（1）：141－143.

［5］陳恒屹，崔社懷.特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展［J］.中華肺部疾病雜志，2009，2（1）：58－62.

［6］李芳，MMP－9和TIMP－1及其在肺纖維化中的作用［J］.中國病理生物學(xué)雜志，2011，6（12）：935－938.

［7］楊晶，劉仲英.冬蟲夏草預(yù)防肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（8）：1310－1312.

［8］張念志，許祥穩(wěn)，李國琳，等.參七蟲草膠囊對(duì)肺纖維化大鼠TGF－β1mRNA表達(dá)的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2010，19（1）：89.

Effects of Shenqichongcao Capsule on Expression of Matrix Metalloproteinase－9 and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase－1in Lung Tissues of Rats with Pulmonary Fibrosis

PAN Zhong－liang1，ZHANG Nian－zhi2，LüYuan－yuan1，CHEN Jing－jing1，WEI Shanshan1，XIE Qin1
（1.Graduate Division，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China；2.Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China）

Objective To investigate the action mechanism of Shenqichongcao Capsule in the treatment of pulmonary fibrosis.Methods Eighty male Sprague－Dawley rats were randomly and equally divided into blank group，model group，prednisone group，and Shenqichongcao Capsule group.In the model group，prednisone group，and Shenqichongcao Capsule group，a rat model of pulmonary fibrosis was induced by intratracheal instillation of bleomycin.Then，the prednisone group and Shenqichongcao Capsule group received prednisone and Shenqichongcao Capsule，respectively，and the blank group and model group received an equal volume of normal saline.On days 15and 30of treatment，the pathological changes of lung tissues were evaluated，and the expression of matrix metalloproteinase－9（MMP－9）and tissue inhibitor of metalloproteinase－1（TIMP－1）in lung tissues was measured by immunohistochemistry.Results Compared with the model group，the Shenqichongcao Capsule group and prednisone group had significantly reduced alveolar inflammation and pulmonary fibrosis and significantly decreased expression of MMP－9and TIMP－1in lung tissues at all time points（P＜0.05or P＜0.01）.Conclusion Shenqichongcao Capsule can inhibit the alveolar inflammation in the early stage of pulmonary fibrosis，possibly by decreasing the expression of MMP－9and TIMP－1in lung tissues.

Shenqichongcao Capsule；pulmonary fibrosis；matrix metalloproteinase；tissue inhibitor of metalloproteinase

R563；R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.025

2013－12－17）

潘中良（1984－），男，碩士研究生，醫(yī)師

張念志，zhangnianzhi6809＠sohu.com