• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基因工程菌發(fā)酵表達(dá)rhG-CSF的條件優(yōu)化

    2014-03-08 03:34:40李希平
    藥學(xué)研究 2014年7期
    關(guān)鍵詞:溶氧補(bǔ)料基因工程

    王 娟,李希平

    (魯南制藥集團(tuán)股份有限公司,山東臨沂273400)

    ·工業(yè)藥學(xué)·

    基因工程菌發(fā)酵表達(dá)rhG-CSF的條件優(yōu)化

    王 娟,李希平

    (魯南制藥集團(tuán)股份有限公司,山東臨沂273400)

    目的通過(guò)優(yōu)化基因工程菌Escherichia coli BL21(DE3)Plys表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGCSF)蛋白的發(fā)酵工藝,提高蛋白產(chǎn)量。方法以100 L規(guī)模發(fā)酵為例,從不同的接種量(1%~10%)、加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)的不同OD600nm值,誘導(dǎo)表達(dá)后的不同溶氧可控制范圍(20%~80%)等方面進(jìn)行優(yōu)化。用SDS-PAGE對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果優(yōu)化后的方案為:采用5%的接種量,在OD600nm達(dá)到10~15時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG,誘導(dǎo)起始后前20 min控制溶氧在80%以下,20 min后通過(guò)補(bǔ)加氨水控制pH在7.0左右,補(bǔ)料調(diào)節(jié)控制溶氧在20%~40%的范圍內(nèi),誘導(dǎo)表達(dá)5 h后收集菌體。優(yōu)化后的發(fā)酵方案極大提高了蛋白表達(dá)量。結(jié)論rhG-CSF蛋白發(fā)酵方案的優(yōu)化對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

    重組人粒細(xì)胞集落刺激因子;發(fā)酵;溶氧;基因工程菌

    20世紀(jì)基因工程技術(shù)誕生以來(lái),應(yīng)用最為廣泛的便是醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域?;蚬こ碳夹g(shù)的快速發(fā)展,使人們能夠快速有效的獲取大量的生物活性物質(zhì),能夠帶來(lái)巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益[1]。利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)與天然產(chǎn)品相比,生物活性在體內(nèi)、外基本一致[2]。G-CSF是調(diào)節(jié)骨髓中粒系造血的主要細(xì)胞因子之一,可選擇性地作用于粒系造血細(xì)胞,促進(jìn)其增殖、分化,并可增加粒系終末分化細(xì)胞即分周血中性粒細(xì)胞的數(shù)目與功能,適用于癌癥化療、放療等原因?qū)е碌闹行粤<?xì)胞減少癥[2~5]。但基因工程發(fā)酵在應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的過(guò)程中,卻往往存在許多例如質(zhì)粒丟失嚴(yán)重,表達(dá)量低等問(wèn)題。在大規(guī)模生產(chǎn)中必須避免這些不穩(wěn)定因素[6]。本文從控制發(fā)酵過(guò)程中的接種量,IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、pH、溶氧等簡(jiǎn)易可控因素出發(fā),篩選出維持rhG-CSF蛋白以100 L規(guī)模發(fā)酵表達(dá)的穩(wěn)定性方案。

    1 材料與方法

    1.1 材料 插入質(zhì)粒pET3a(轉(zhuǎn)入人源G-CSF基因)的基因工程菌E.coli BL21(DE3)PlysS購(gòu)自重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Merk公司;Yeast extract、Tryptone購(gòu)自O(shè)xoid公司;M9培養(yǎng)基及葡萄糖購(gòu)自國(guó)藥公司。30 L-150 L 2聯(lián)體發(fā)酵罐購(gòu)自上海高機(jī)生物公司。

    1.2 方法 甘油菌株于Kan抗性LB平板劃線,37℃培養(yǎng)16~18 h,挑取規(guī)則的單菌落轉(zhuǎn)接入種子瓶37℃培養(yǎng)6~8 h至OD600nm到0.5~1.0之間。10%接種量轉(zhuǎn)入裝有100 LM9培養(yǎng)基的發(fā)酵罐,37℃恒溫通過(guò)恒速補(bǔ)料葡萄糖3 g·(L·h)-1培養(yǎng)5 h后,加1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),并停止補(bǔ)加葡萄糖20 min,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h后,下罐收集菌體,破碎,進(jìn)行純化,SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)和得率。

    1.3 蛋白灰度分析 對(duì)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后的蛋白凝膠進(jìn)行掃描,Bandscan分析,計(jì)算目的蛋白在總蛋白中所占百分比。

    1.4 質(zhì)粒丟失率計(jì)算 發(fā)酵結(jié)束時(shí)的菌液稀釋涂布LB平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜,每個(gè)平板用牙簽挑取100個(gè)菌落,影印至含Kan抗性的LB平板和普通LB平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜,抗性板菌落對(duì)比普通板菌落計(jì)算得出質(zhì)粒丟失率。

    1.5 優(yōu)化方法[2~10]實(shí)驗(yàn)分別從誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、接種量、誘導(dǎo)起始期及誘導(dǎo)后的參數(shù)控制等方面多次進(jìn)行100 L規(guī)模的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

    2 結(jié)果

    2.1 誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)機(jī)選擇 以接種培養(yǎng)后菌懸液的OD600nm為標(biāo)準(zhǔn),設(shè)定5~10、10~15、15~20三個(gè)范圍確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在OD600nm為10~15時(shí),加入IPTG開(kāi)始誘導(dǎo),最后的蛋白表達(dá)水平最高,SDS-PAGE蛋白電泳凝膠的Bandscan分析顯示,蛋白灰度百分比可高達(dá)43.0 %(見(jiàn)表1)。而若當(dāng)OD600nm達(dá)5~10或15~20時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),最后的蛋白灰度百分比僅分別達(dá)37.6%及14.3%。

    圖1 SDS-PAGE檢測(cè)rhG-CSF在E.coli BL21(DE3)PLysS中的表達(dá)水平

    表1 目的蛋白灰度對(duì)比(%)

    2.2 接種量?jī)?yōu)化 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以1%、3%、5%、8%和10%的接種量對(duì)比,進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明采用1%和3%接種量時(shí),達(dá)到OD600nm10~15需要6~8 h,而采用5%~10%接種量時(shí)達(dá)到最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)所需要的時(shí)間為4~5.5 h;而且蛋白分析數(shù)據(jù)顯示在5%接種量時(shí),細(xì)菌最后表達(dá)目的蛋白的比例最高,其蛋白灰度百分比為43.2%(見(jiàn)圖1、表1)。因此最終確定5%接種量為最佳。

    2.3 誘導(dǎo)期優(yōu)化 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的過(guò)程中,為避免補(bǔ)加葡萄糖對(duì)蛋白表達(dá)的抑制作用,在誘導(dǎo)期間停止補(bǔ)加葡萄糖20 min。在此期間我們通過(guò)調(diào)整轉(zhuǎn)速以及通入氧氣的量,改變發(fā)酵液溶氧量進(jìn)行優(yōu)化。最后的質(zhì)粒穩(wěn)定性(按國(guó)家藥典檢測(cè)方法獲取質(zhì)粒的丟失率)測(cè)定結(jié)果表明誘導(dǎo)期維持溶氧在80%以下為更佳(見(jiàn)表2)。

    表2 不同溶氧質(zhì)粒丟失率

    誘導(dǎo)后,采取補(bǔ)料培養(yǎng)的生長(zhǎng)方式。我們對(duì)補(bǔ)料速度進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)罐體溶氧以及pH的變化,調(diào)控補(bǔ)料速度;在發(fā)酵罐維持恒定轉(zhuǎn)速(200 rpm)和恒定通氣量(0.3 m3·h-1)時(shí),通過(guò)補(bǔ)加氨水的方式控制菌液pH在7.0左右,調(diào)控補(bǔ)料速度以維持溶氧分別在20%~40%、40%~60%及60%~80%的范圍。誘導(dǎo)5 h后收集菌液,SDSPAGE電泳檢測(cè)蛋白的表達(dá)并且對(duì)包涵體收率進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果表明溶氧控制在20%~40%之間,目的蛋白的表達(dá)效果最好(圖2、表3、4)。

    表3 不同溶氧范圍包涵體收率

    圖2 SDS-PAGE檢測(cè)rhG-CSF在E.coli BL21(DE3)PLysS中的表達(dá)水平

    表4 目的蛋白灰度對(duì)比(%)

    3 討論

    利用基因重組技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)人粒細(xì)胞集落刺激因子rhG-CSF已經(jīng)備受關(guān)注,我們通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到較優(yōu)的發(fā)酵條件,實(shí)現(xiàn)了rhG-CSF蛋白的高效穩(wěn)定表達(dá),同時(shí)為向更大規(guī)模的生產(chǎn)提供了可靠的數(shù)據(jù)方案,具有重要的理論及應(yīng)用價(jià)值。

    在蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)工藝中,接種量及蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)產(chǎn)量具有重要的影響,以我們的發(fā)酵為例,100 L培養(yǎng)基的接種量為10%,雖然縮短了誘導(dǎo)前的培養(yǎng)時(shí)間,也從而縮短整個(gè)發(fā)酵周期,但如此操作,菌種在前期生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生許多不利于菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的因子,反而抑制了菌種后期目的蛋白的表達(dá);以接種后補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)間作為標(biāo)準(zhǔn)確定蛋白誘導(dǎo)起始時(shí)間,由于多種不確定的影響因素,可重復(fù)性、參考性較差,故本論文優(yōu)化過(guò)程中以O(shè)D600nm為標(biāo)準(zhǔn),大大增強(qiáng)其參考價(jià)值。

    另外,基因工程菌的部分菌株在誘導(dǎo)表達(dá)前會(huì)有一定的本底表達(dá)[11],而表達(dá)產(chǎn)物大部分對(duì)菌株都是有害的,這不利于菌株后期的生長(zhǎng)及蛋白的表達(dá)。在100 L實(shí)際發(fā)酵表達(dá)中,由于生長(zhǎng)條件如攪拌、通氣等的變化,也會(huì)影響誘導(dǎo)前的本底表達(dá)。我們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中采用的是恒定補(bǔ)料的培養(yǎng)方式,補(bǔ)料培養(yǎng)基是以一定的C/N配制而成的,碳源的主要成分是葡萄糖,氮源則是酵母提取物與蛋白胨按照比例混合而成。通過(guò)在種子中增加相應(yīng)的葡萄糖,發(fā)酵中通過(guò)pH以及溶氧的參數(shù)反饋,在菌體起始生長(zhǎng)階段以稍過(guò)量的葡萄糖補(bǔ)料抑制本底表達(dá),但是如果補(bǔ)料速度過(guò)快,葡萄糖濃度過(guò)高會(huì)造成過(guò)量的乙酸形成,導(dǎo)致pH迅速下降,溶氧迅速下降,抑制蛋白表達(dá);故在誘導(dǎo)起始時(shí)需通過(guò)間歇停止補(bǔ)糖解除對(duì)蛋白表達(dá)的抑制作用;另外如果補(bǔ)料停止,攪拌和通氣卻仍然維持,就會(huì)造成碳源不足,pH、溶氧上升并維持在高位100 %以上,菌體生長(zhǎng)趨于利用氮源,亦不利于質(zhì)粒的穩(wěn)定及目的蛋白的表達(dá)和積累[12]。

    發(fā)酵過(guò)程中,為了維持罐體內(nèi)的溶氧范圍同時(shí)避免罐體壓力泄露造成染菌,一般維持罐內(nèi)壓力在0.05~0.1 MPa之間。但是這同時(shí)增加了罐體內(nèi)其他氣體的分壓,例如CO2,高溶解CO2不利于后期的表達(dá)[13]。因此在誘導(dǎo)前維持較高的罐壓,可以避免接種后延滯期染菌,同時(shí)較高溶解CO2抑制菌株的本底表達(dá);而誘導(dǎo)過(guò)程中,將罐壓降至0.02 MPa左右,結(jié)合其他因素的控制可提高目的蛋白的表達(dá)。

    據(jù)鄭劍等[14]的研究,用甘油做培養(yǎng)基能夠避免葡萄糖對(duì)細(xì)菌蛋白表達(dá)的抑制作用,提高總體菌體量,并增加所有蛋白的表達(dá)。而乳糖可起到相應(yīng)的誘導(dǎo)作用又可促進(jìn)后期菌體的生長(zhǎng)及目的蛋白的表達(dá),也可作為一種備選碳源。此外,可溶性表達(dá)也是蛋白表達(dá)的一個(gè)重要研究方向[15]。

    總之,rhG-CSF蛋白的發(fā)酵工藝還有很大優(yōu)化的潛能,還有許多問(wèn)題值得思考。

    [1]熊宗貴.生物技術(shù)制藥[M].北京:中國(guó)高等教育出版社,1999:65-109.

    [2]Krishna Rao DV,Ramu CT,Rao JV,et al.Impact of dissolved oxygen concentration on some key parameters and production of rhG-CSF in batch fermentation[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35(9):991-1000.

    [3]Khalilzadeh R,Mohammadian-Mosaabadi J,Bahrami A,et al.Process development for production of human granulocyte-colony stimulating factor by high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35(12):1643-1650.

    [4]Yim S,Jeong K,Chang H,et al.High-level secretory production of human granulocyte-colony stimulating factor by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli[J].Bioprocess Biosyst Eng,2001,24(4):249-254.

    [5]Das KM,Banerjee S,Shekhar N,et al.Cloning,soluble expression and purification of high yield recombinant hGMCSF in Escherichia coli[J].Int JMol Sci,2011,12(3):2064-2076.

    [6]Babaeipour V,Abbas MP,Sahebnazar Z,et al.Enhancement of human granulocyte-colony stimulating factor production in recombinant E.coli using batch cultivation[J].Bioprocess Biosyst Eng,2010,33(5):591-598.

    [7]李民,陳常慶.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展,2000,20(2):26-31.

    [8]劉社際,楊立明.重組人生長(zhǎng)激素在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)研究[J].生物技術(shù)通訊,2000,11(4):264-267.

    [9]楊煒,王偉剛,田海英,等.重組大腸桿菌高表達(dá)高密度發(fā)酵研究[J].生物技術(shù),2006,16(3):83-86

    [10]薛文嬌.重組E.coli生產(chǎn)類人膠原蛋白發(fā)酵調(diào)控策略與500L中試規(guī)模放大方法優(yōu)化[D].西北大學(xué),2009.

    [11]李會(huì)成,李文輝.基因工程菌的發(fā)酵研究[J].生物工程進(jìn)展,1997,17(2):40-43.

    [12]kesson M,Hagander P,Axelsson JP.A probing feeding strategy for Escherichia coli cultures[J].Biotechnology Techniques,1999,13(8):523-528.

    [13]Pan JG,Rhee JS,Lebeault JM.Physiological constraints in increasing biomass concentration of Escherichia coli B in fed-batch culture[J].Biotechnol Lett,1987,9(2):89-94.

    [14]鄭劍,吳琳琳,李敏.乳糖誘導(dǎo)高分子量重組蛛絲蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J].中國(guó)生物工程雜志,2008,28(12):41-46.

    [15]Zhu F,Wang Q,Pu H,et al.Optimization of soluble human interferon-γproduction in Escherichia coli using SUMO fusion partner[J].World JMicrobiol Biotechnol,2013,29(2):319-325.

    Optim ization of the fermentation of rhG-CSF using recom bined strain

    WANG Juan,LIXi-ping
    (Lunan Pharmaceutical Group Corporation,Linyi273400,China)

    ObjectiveTo improve the rhG-CSF protein from the recombined strain Escherichia coli BL21(DE3)Plys,the batch fermentation conditions was optimesed.MethodsWe determined the influence of the parameters at some crucial control points,including different inoculation amount(1%~10%),the OD600nmof fermentation culturewhen adding inducer IPTG and the different concentrations of dissolved oxygen(DO)(20%~80%)on the final protein expression in 100 L batch level fermentation.A SDS-PAGEwas used to analyze the protein expression.ResultsThe optimized fermentation condition was as follow:inoculum quantity 5%,IPTG should be added when the OD600nmof culture reaches10~15,at the beginning of inducing the expression of object protein,the DO concentration was controlled under 80%;After inducing 20 min,the pH ofmedium was kept at around 7.0 by adding ammonia,the DO concentration was keptat20%~40%;The bacteria was collected after inducing 5 hours.The production of rhG-CSFwas higher after optimizing the fermentation conditions.ConclusionThe optimized fermentation conditions for rhG-CSF production in E.coli BL21(DE3)Plys provided import direction for its large scale preparation.

    rhG-CSF;Fermentation;Dissolved oxygen;Genetic engineered stains

    Q812

    :A

    2095-5375(2014)07-0428-003

    王娟,女,研究方向:基因工程菌的發(fā)酵表達(dá)與工業(yè)化,E-mail:tuky2003@163.com

    猜你喜歡
    溶氧補(bǔ)料基因工程
    基因工程小鼠飼養(yǎng)繁育及鑒定策略
    “自然科學(xué)—人文探討”在基因工程課程思政中的應(yīng)用
    福建輕紡(2022年4期)2022-06-01 06:26:10
    反應(yīng)型冷補(bǔ)料與溶劑型冷補(bǔ)料路用性能對(duì)比研究
    基因工程菌有什么本領(lǐng)?
    軍事文摘(2020年14期)2020-12-17 06:27:28
    精補(bǔ)料增重凈能對(duì)西雜肉牛育肥性能和成本的影響
    7月增氧有學(xué)問(wèn),如何在對(duì)蝦養(yǎng)殖中后期做好溶氧管理?
    物聯(lián)網(wǎng)監(jiān)控獲得的溶解氧曲線與池塘水質(zhì)指標(biāo)的內(nèi)在關(guān)系
    口蹄疫基因工程疫苗研究進(jìn)展
    增氧泵如何合理使用?
    一種發(fā)電機(jī)定子冷卻水低溶氧控制方法探討
    人妻少妇偷人精品九色| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费观看性生交大片5| 久久久久久伊人网av| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久久久久人妻| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品久久久久久久久av| 一区在线观看完整版| 国产毛片在线视频| 亚洲成人一二三区av| 久久青草综合色| 精品一区二区免费观看| 国产伦理片在线播放av一区| 天堂俺去俺来也www色官网| 18禁在线播放成人免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美97在线视频| 国产成人91sexporn| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日韩欧美精品免费久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 大香蕉久久网| 亚洲国产精品国产精品| 99九九在线精品视频| 成人国语在线视频| 精品熟女少妇av免费看| 青春草视频在线免费观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久99热这里只频精品6学生| 夜夜爽夜夜爽视频| 女人精品久久久久毛片| 热re99久久精品国产66热6| 久久免费观看电影| 一本大道久久a久久精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 一级毛片 在线播放| 国产国语露脸激情在线看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 久久精品国产a三级三级三级| 有码 亚洲区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲精品日韩av片在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 国产乱来视频区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 美女主播在线视频| kizo精华| 9色porny在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 一级毛片 在线播放| 久久这里有精品视频免费| 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩制服骚丝袜av| 国产欧美亚洲国产| 女性被躁到高潮视频| 男女无遮挡免费网站观看| 一本久久精品| 亚洲av二区三区四区| 五月伊人婷婷丁香| 美女主播在线视频| 18+在线观看网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美另类一区| 欧美激情国产日韩精品一区| 人妻人人澡人人爽人人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品午夜福利在线看| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 在线看a的网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 91久久精品国产一区二区成人| 成人国产麻豆网| 99视频精品全部免费 在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 青青草视频在线视频观看| 两个人的视频大全免费| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品成人在线| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲内射少妇av| 亚洲精品一区蜜桃| 超色免费av| 国产片特级美女逼逼视频| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产精品一区三区| 夜夜爽夜夜爽视频| 麻豆成人av视频| 九色亚洲精品在线播放| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久久久久久成人| 好男人视频免费观看在线| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品亚洲成a人片在线观看| 成人手机av| 国产高清三级在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 97在线人人人人妻| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲怡红院男人天堂| 99re6热这里在线精品视频| 老司机影院毛片| 国产精品久久久久久久久免| 精品久久久久久电影网| 亚洲国产精品999| 在线观看免费高清a一片| 久久99蜜桃精品久久| 日韩一区二区视频免费看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 免费av不卡在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲人与动物交配视频| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品.久久久| 欧美性感艳星| 一级爰片在线观看| 制服诱惑二区| 久久久久久久大尺度免费视频| 街头女战士在线观看网站| 国产成人aa在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 欧美日韩亚洲高清精品| 99久久精品国产国产毛片| 国产男女内射视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久久久伊人网av| 久久久午夜欧美精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲怡红院男人天堂| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲av二区三区四区| 久久久久久久久久久丰满| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成人免费观看视频高清| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 人妻少妇偷人精品九色| 久久综合国产亚洲精品| 99热这里只有精品一区| 妹子高潮喷水视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产乱来视频区| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲av成人精品一区久久| 国产日韩欧美在线精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久 成人 亚洲| 丝袜脚勾引网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 秋霞在线观看毛片| 永久网站在线| 欧美精品一区二区免费开放| 久久精品国产自在天天线| 99久久精品一区二区三区| 免费人成在线观看视频色| 蜜桃在线观看..| 美女主播在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩av免费高清视频| 午夜久久久在线观看| 伦理电影大哥的女人| 久久久久国产网址| 永久网站在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产黄色免费在线视频| 国产成人91sexporn| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久人人爽人人片av| 成人国产av品久久久| 大香蕉97超碰在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 日本wwww免费看| 高清视频免费观看一区二区| 如何舔出高潮| 嫩草影院入口| 国产高清国产精品国产三级| 高清av免费在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 嫩草影院入口| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 九草在线视频观看| 满18在线观看网站| 久久99蜜桃精品久久| 91久久精品电影网| 高清视频免费观看一区二区| 九草在线视频观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品一国产av| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看三级黄色| 99九九线精品视频在线观看视频| 大片免费播放器 马上看| 热re99久久国产66热| 性色avwww在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 飞空精品影院首页| 久久狼人影院| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲av成人精品一区久久| 久久国内精品自在自线图片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产视频内射| 亚洲精品中文字幕在线视频| 特大巨黑吊av在线直播| 男人添女人高潮全过程视频| 黑丝袜美女国产一区| 久久免费观看电影| 搡女人真爽免费视频火全软件| 七月丁香在线播放| 精品久久久久久久久av| 搡老乐熟女国产| 国精品久久久久久国模美| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩 亚洲 欧美在线| 自线自在国产av| 亚洲三级黄色毛片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 精品国产露脸久久av麻豆| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品一区二区免费观看| 少妇的逼好多水| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人无遮挡网站| 各种免费的搞黄视频| 午夜激情久久久久久久| 日韩强制内射视频| 午夜福利视频精品| 美女国产高潮福利片在线看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av线在线观看网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| videosex国产| 制服丝袜香蕉在线| 国产精品女同一区二区软件| 青春草国产在线视频| 一级黄片播放器| 蜜桃国产av成人99| 久久久精品区二区三区| 丝袜喷水一区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一级毛片aaaaaa免费看小| 成人毛片60女人毛片免费| 老女人水多毛片| av专区在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 日韩一区二区视频免费看| 赤兔流量卡办理| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩欧美一区视频在线观看| h视频一区二区三区| 免费av不卡在线播放| 欧美xxⅹ黑人| 最新中文字幕久久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男女边摸边吃奶| 97超碰精品成人国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 99国产精品免费福利视频| 亚洲经典国产精华液单| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中文天堂在线官网| 超色免费av| 亚洲精品亚洲一区二区| 一区二区三区乱码不卡18| 91精品国产国语对白视频| 成年人午夜在线观看视频| 三级国产精品片| 国产黄色免费在线视频| av播播在线观看一区| 国产视频内射| 一二三四中文在线观看免费高清| 一级毛片我不卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产伦理片在线播放av一区| 免费观看av网站的网址| 日韩中字成人| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲国产日韩一区二区| 伦理电影大哥的女人| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日本wwww免费看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美性感艳星| 插阴视频在线观看视频| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品人妻在线不人妻| 全区人妻精品视频| 亚洲四区av| 国产视频内射| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 日本免费在线观看一区| 婷婷色综合大香蕉| 伦理电影免费视频| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲图色成人| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲久久久国产精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲av成人精品一二三区| av一本久久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美3d第一页| 免费少妇av软件| 国产探花极品一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久精品94久久精品| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲成人一二三区av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 99热全是精品| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久久精品免费免费高清| 全区人妻精品视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲图色成人| 在线观看免费视频网站a站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成人无遮挡网站| 熟女人妻精品中文字幕| 一本大道久久a久久精品| 在线观看www视频免费| av专区在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 久久鲁丝午夜福利片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美精品一区二区免费开放| 十分钟在线观看高清视频www| a级毛片免费高清观看在线播放| 丰满乱子伦码专区| 免费大片18禁| 老女人水多毛片| 18+在线观看网站| 日本免费在线观看一区| 日日爽夜夜爽网站| 日韩一区二区三区影片| 国产精品无大码| 高清av免费在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 少妇熟女欧美另类| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| av黄色大香蕉| 国产乱人偷精品视频| 不卡视频在线观看欧美| av网站免费在线观看视频| 一本色道久久久久久精品综合| 91精品伊人久久大香线蕉| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久久伊人网av| 国产精品久久久久久av不卡| 久久精品夜色国产| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 我的女老师完整版在线观看| 精品国产国语对白av| 亚洲少妇的诱惑av| 最近中文字幕2019免费版| av福利片在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产毛片在线视频| 欧美日韩视频精品一区| 精品少妇久久久久久888优播| 国产视频内射| 欧美激情国产日韩精品一区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产亚洲一区二区精品| 午夜激情久久久久久久| 亚洲四区av| 日韩视频在线欧美| 久久99一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| tube8黄色片| 久久久久久久久久人人人人人人| 午夜av观看不卡| 天堂8中文在线网| 纯流量卡能插随身wifi吗| 岛国毛片在线播放| www.色视频.com| 丰满少妇做爰视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久久视频综合| 国内精品宾馆在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 人成视频在线观看免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品一国产av| 99国产精品免费福利视频| 国产精品偷伦视频观看了| 观看美女的网站| 午夜精品国产一区二区电影| 国产免费现黄频在线看| 哪个播放器可以免费观看大片| 中文字幕av电影在线播放| 飞空精品影院首页| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 人妻人人澡人人爽人人| 夜夜爽夜夜爽视频| 人成视频在线观看免费观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费大片黄手机在线观看| 大码成人一级视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 插逼视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 18+在线观看网站| 国产 一区精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 天天影视国产精品| 亚洲精品视频女| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美97在线视频| 久久99精品国语久久久| 亚洲,一卡二卡三卡| 老司机亚洲免费影院| 少妇的逼水好多| 精品久久久久久久久亚洲| 一区二区三区乱码不卡18| av专区在线播放| 观看av在线不卡| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产一区二区在线观看日韩| 高清欧美精品videossex| 人妻 亚洲 视频| videosex国产| 五月伊人婷婷丁香| 99久久精品国产国产毛片| 免费看不卡的av| 少妇人妻久久综合中文| 国产黄色视频一区二区在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚州av有码| 久久影院123| 三上悠亚av全集在线观看| 久久99一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久久人妻| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产成人av激情在线播放 | 亚洲三级黄色毛片| 免费高清在线观看视频在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 免费高清在线观看视频在线观看| 美女福利国产在线| 免费人成在线观看视频色| 日本av免费视频播放| 成人无遮挡网站| 成年女人在线观看亚洲视频| 午夜av观看不卡| 一本久久精品| 另类亚洲欧美激情| 视频区图区小说| 久久精品夜色国产| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费av中文字幕在线| 丝瓜视频免费看黄片| 精品人妻偷拍中文字幕| 在线观看免费高清a一片| 午夜影院在线不卡| 欧美日韩成人在线一区二区| 嫩草影院入口| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产成人91sexporn| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品久久久久久久电影| 人人澡人人妻人| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 免费观看av网站的网址| 精品久久久久久久久av| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产综合精华液| 日本黄色片子视频| 亚洲性久久影院| 国产精品成人在线| av一本久久久久| 久久精品国产亚洲网站| 久久亚洲国产成人精品v| 18在线观看网站| 免费av中文字幕在线| 日本91视频免费播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 久久亚洲国产成人精品v| 亚州av有码| 91精品国产九色| 两个人的视频大全免费| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久热这里只有精品99| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 水蜜桃什么品种好| 亚洲人成77777在线视频| 人人澡人人妻人| 日韩一区二区视频免费看| 国产成人91sexporn| 亚洲精品456在线播放app| 久久久久久久久久久久大奶| 嫩草影院入口| 伦精品一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 丝袜在线中文字幕| 久久久亚洲精品成人影院| 日韩欧美精品免费久久| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产成人精品婷婷| 免费黄网站久久成人精品| 久久99精品国语久久久| 久久久久网色| 全区人妻精品视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 人妻 亚洲 视频| 精品久久蜜臀av无| 久久久久久久久久久丰满| 欧美日韩在线观看h| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲精品美女久久av网站| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99久久精品一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费观看a级毛片全部| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久亚洲精品成人影院| 在线 av 中文字幕| 天堂中文最新版在线下载| 成人无遮挡网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产精品一区二区在线不卡| 少妇的逼水好多| 久久久精品94久久精品| 国产日韩欧美在线精品| 国产成人免费观看mmmm| 国产爽快片一区二区三区| 国产一区二区三区av在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲av国产av综合av卡| 下体分泌物呈黄色| 两个人的视频大全免费| 老司机影院成人| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 美女内射精品一级片tv| 亚洲经典国产精华液单| 国产成人a∨麻豆精品| 看十八女毛片水多多多| 久久97久久精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久青草综合色| 十八禁网站网址无遮挡| 日本爱情动作片www.在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 夫妻午夜视频| 日韩一区二区视频免费看| 97在线视频观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品久久国产蜜桃| 午夜免费观看性视频| 黑人猛操日本美女一级片| 久久毛片免费看一区二区三区| 黑人猛操日本美女一级片| 另类亚洲欧美激情| 91久久精品国产一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 欧美另类一区| 熟女av电影| 观看美女的网站| 成年人免费黄色播放视频| 国产高清有码在线观看视频| 黄色一级大片看看| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲成色77777| 性色avwww在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲综合精品二区| 全区人妻精品视频| a级毛片黄视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 水蜜桃什么品种好| 久久久午夜欧美精品| 人妻系列 视频| 国产一区二区三区av在线|