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    穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌PAO1誘發(fā)小鼠感染模型的體內(nèi)保護(hù)作用研究

    2014-03-08 09:02:06何巧陳思敏王志華何敏諶立巍
    中藥與臨床 2014年6期
    關(guān)鍵詞:穿心蓮銅綠菌液

    何巧,陳思敏,王志華,何敏,諶立巍

    穿心蓮內(nèi)酯為中藥穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees重要的藥效成分之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽、治療心腦血管疾病等多種作用[1~2]。其中有研究顯示穿心蓮內(nèi)酯抗菌作用范圍廣泛,對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等具有較強(qiáng)的抑菌作用,在臨床上具有良好的療效,并可有效降低銅綠假單胞菌毒力因子如綠膿菌素、胞外蛋白水解酶、彈性蛋白酶活性從而實(shí)現(xiàn)抗感染作用[3~4]。本課題組在前期的中藥抗菌有效成分研究的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)影響銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS),降低該菌的耐藥性發(fā)揮抗菌作用[5]。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用小鼠腹腔感染銅綠假單胞菌PAO1,考察穿心蓮內(nèi)酯配比左氧氟沙星的體內(nèi)抗感染作用,為將該藥物開(kāi)發(fā)成抗菌藥物增效劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 菌種

    銅綠假單胞菌PAO1野生株(Pseudomonasaeruginosa O1,PAO1)由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所贈(zèng)送。原始菌種保存于-20℃冰箱(甘油保存);試驗(yàn)前菌種于M-H(A)平板復(fù)活后,選取長(zhǎng)勢(shì)良好的單一菌團(tuán)涂抹于M-H(A)斜面,35℃隔夜孵育后密封,4℃冷藏保存?zhèn)溆?;試?yàn)前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板,35℃孵育過(guò)夜,即可使用。

    1.2 試藥

    穿心蓮內(nèi)酯(四川禾嘉華福寧制藥有限公司,生產(chǎn)批號(hào):cxltqw20110528),經(jīng)高效液相色譜(HPLC)鑒定,純度高于99%;左氧氟沙星(上虞京新藥業(yè),生產(chǎn)批號(hào):DK20-1202093),經(jīng)經(jīng)銷(xiāo)廠家HPLC測(cè)定后,純度達(dá)97.4%,符合實(shí)驗(yàn)要求;M-H(A)和M-H(B)培養(yǎng)基(OXOID公司,CM0337A和CM0405B);其他耗材均由成都雅榮生化設(shè)備經(jīng)營(yíng)部購(gòu)買(mǎi)提供。

    1.3 儀器

    全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀(Thermo 公司);MILLIPORE Synergy超純水儀(Milipore公司);超凈工作臺(tái)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);精密恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);低溫冷凍離心機(jī)Sorvall ST 16R(Thermo Fisher)。

    1.4 動(dòng)物

    SPF級(jí)KM種小白鼠,18-22 g,雌雄各半,四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(生產(chǎn)合格證號(hào):川實(shí)動(dòng)質(zhì)管第005號(hào);實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào):川實(shí)動(dòng)質(zhì)管第022號(hào))。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 穿心蓮內(nèi)酯的協(xié)同抗感染作用

    2.1.1 復(fù)制小鼠PAO1腹腔感染模型 將保存于斜面的銅綠假單胞菌PAO1 35℃隔夜孵育復(fù)活,挑3~4個(gè)單菌落溶于4 mL M-H(B)培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)菌濃度為0.5麥?zhǔn)希?.5×108CFU.mL-1)濃度,并稀釋定容至40 mL;用無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使細(xì)菌均勻混懸后將菌液隔夜增菌培養(yǎng)16 h(35℃,空氣搖床振搖16 h),次日取出原菌液測(cè)OD值(細(xì)菌生長(zhǎng)飽和期)。取20 mL,分裝于離心管中,每管2 mL,離心(10000~15000 rpm.min-1,10 min),棄上清液,用2 mL生理鹽水混勻后,再離心(15000 rpm.min-1,10 min),棄上清液;再在離心管中加入生理鹽水2 mL,用吸管充分混勻后收集細(xì)菌細(xì)胞菌體2 mL,設(shè)定該菌液為100菌液濃度,用0.5%的滅菌胃膜素(mucin)進(jìn)行稀釋?zhuān)♂屩?0-1,10-2,10-3,10-4備用。取體重18~22 g的小鼠,隨機(jī)分組,每組8只,分別ip 注射上述菌液至小鼠體內(nèi),0.5 mL/只。觀察記錄各組小鼠24 h死亡情況,以致小鼠90%~100%死亡的最低感染菌量做為最小致死菌量(MLD)。結(jié)果顯示10-2為最佳劑量,以該菌量做為體內(nèi)感染的菌量復(fù)制小鼠感染模型。

    2.1.2 摸出給藥的合適劑量范圍 得出銅綠假單胞菌MLD后,以左氧氟沙星的臨床指定劑量計(jì)算小鼠給藥劑量,并以該劑量為最高劑量,再10倍稀釋左氧氟沙星共獲得6個(gè)劑量,再分別灌胃給予小鼠不同劑量的左氧氟沙星,摸出致感染細(xì)菌的小鼠出現(xiàn)0%~100%存活(或者死亡)的給藥劑量范圍。選擇小鼠存活率為40%~50%時(shí)左氧氟沙星劑量。結(jié)果顯示左氧氟沙星的最佳劑量為0.2 mg.kg-1。

    2.1.3 穿心蓮內(nèi)酯和左氧氟沙星配比劑量范圍 以2.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),將左氧氟沙星的劑量固定為0.2 mg.kg-1,選擇4個(gè)較佳配合穿心蓮內(nèi)酯的組合為受試藥物.具體見(jiàn)表1。

    表1 穿心蓮內(nèi)酯配比左氧氟沙星劑量

    2.1.4 體內(nèi)保護(hù)性實(shí)驗(yàn) 取健康KM小鼠,體重18~22 g,隨機(jī)分組,每組50只鼠,雌雄各半,分別腹腔感染1 MLD菌量的受試菌液,0.5 mL/只,感染后即刻灌胃給予不同受試藥物,僅給一次,給藥后觀察并記錄各給藥組小鼠的死亡數(shù)(或存活數(shù)),連續(xù)觀察3天(72 h)。同時(shí)設(shè)感染對(duì)照組及空白對(duì)照組。

    2.1.5 統(tǒng)計(jì)處理 根據(jù)各組小鼠死亡數(shù)(或存活數(shù))用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件17.0,采用X2方法統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

    2.1.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 具體見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總體顯示左氧氟沙星配比一定劑量穿心蓮內(nèi)酯,有提高左氧氟沙星體內(nèi)抗感染保護(hù)作用的趨勢(shì),且在配合穿心蓮內(nèi)酯0.28×10-3時(shí),藥物的體內(nèi)保護(hù)作用要優(yōu)于單獨(dú)使用左氧氟沙星(p<0.05),提示穿心蓮內(nèi)酯可增強(qiáng)銅綠假單胞菌對(duì)左氧氟沙星的敏感性。

    表2 穿行連內(nèi)酯配比左氧氟沙星對(duì)PAO1腹腔感染模型的體內(nèi)保護(hù)作用

    2.2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌PAO1 24 h生長(zhǎng)速率的影響

    2.2.1 樣品配制 稱(chēng)取穿心蓮內(nèi)酯300 mg,加入3 mL二甲基亞砜(DMSO)配成100 mg.mL-1的穿心蓮內(nèi)酯DMSO溶液。吸取1 mL 100 mg.mL-1的藥液加入9 mL DMSO得10 mg.mL-1的藥液,依次配制1、0.1、0.01、0.001 mg.mL-1的藥液。將4℃冷藏保存的PAO1轉(zhuǎn)染至M-H(A)平板上隔夜培養(yǎng)。將長(zhǎng)勢(shì)良好的1~2個(gè)傳代菌落用生理鹽水調(diào)至菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛?。精密量?0 μL藥液與9.98 mL M-H(B)培養(yǎng)基均勻混合,裝于消毒試管中,再精密吸取10 μL菌液,渦旋儀充分混勻受試樣本。分別吸取200 μL加入96孔板中,每組8個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)僅加入相同劑量DMSO空白對(duì)照組(組7)和僅加入培養(yǎng)基的空白對(duì)照組(組8)。具體見(jiàn)表3。

    表3 試管基質(zhì)中菌量和各組藥物含量

    2.2.2樣品檢測(cè) 將加有樣本的96孔板在35℃培養(yǎng)箱中孵育,每隔1h,取樣品在420 nm全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀下測(cè)OD值。將空白組各孔OD值取平均值,設(shè)為OD0。

    2.2.3 數(shù)據(jù)處理 記錄各組數(shù)據(jù),每組取平均值,各組OD值減去OD0作為該組OD值。并作圖表示。

    2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示,穿心蓮內(nèi)酯各組生長(zhǎng)曲線(xiàn)與DMSO空白組之間無(wú)差異具體見(jiàn)圖1。提示穿心蓮內(nèi)酯不影響PAO1的生長(zhǎng),且DMSO對(duì)PAO1無(wú)影響。

    圖1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌24h內(nèi)生長(zhǎng)的影響

    3 討論

    抗生素長(zhǎng)期應(yīng)用導(dǎo)致臨床有效率不斷降低,而且藥物的大量使用還可誘導(dǎo)細(xì)菌的高度耐藥和多重耐藥的產(chǎn)生,所以臨床相關(guān)感染的治療變得非常棘手。長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐證實(shí)中藥在細(xì)菌感染性疾病治療方面具有明確的療效,穿心蓮是清熱解毒中藥中的代表之一,長(zhǎng)期用于細(xì)菌感染的治療,療效確切。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)是臨床上獲得性感染的重要條件致病菌,常引起呼吸道感染、菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、燒傷感染和囊性纖維化繼發(fā)感染等多種疾病[6]。近年來(lái),由于大量強(qiáng)效抗菌藥物的廣泛使用,使該菌種呈現(xiàn)出天然或獲得性多重耐藥,造成難以治愈的嚴(yán)重感染[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立銅綠假單胞菌PAO1小鼠腹腔感染模型,以動(dòng)物死亡率為指標(biāo)考察藥物的體內(nèi)保護(hù)作用。結(jié)果顯示在一定的配比劑量下,加入了穿心蓮內(nèi)酯的左氧氟沙星普遍表現(xiàn)出保護(hù)性作用增強(qiáng);但是通過(guò)測(cè)定24 h細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn),顯示穿心蓮內(nèi)酯沒(méi)有直接影響細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和目前穿心蓮內(nèi)酯的抗菌作用研究進(jìn)展,提示穿心蓮內(nèi)酯在體內(nèi)可能還通過(guò)其它途徑發(fā)揮抗菌協(xié)同作用。

    [1] 楊靜.穿心蓮內(nèi)酯的研究進(jìn)展[J].中草藥,2009,40(7):1168.

    [2] 史傳英,董六一.亞硫酸氫鈉穿心蓮內(nèi)酯的抗炎解熱鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2009,18(12):5.

    [3] 李洪濤,吳春民,覃慧敏,等.穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌PAO1株MexAB-OprM外排泵mRNA表達(dá)的影響[J].中華傳染病雜志,2007,25(6):338.

    [4] 李洪濤,覃慧敏,王衛(wèi)華,等.穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌QS毒力因子的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2006,31(12):1015.

    [5] 陳思敏,諶立巍,何敏,等.穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌PAO1生物被膜形成的及對(duì)lasR/rhlR表達(dá)的調(diào)控機(jī)制[J].中藥與臨床2014,30(2):24.

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