超聲輔助提取禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩工藝研究

池承燈，施清涼，陳紫紅，陳繼承

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

超聲輔助提取禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩工藝研究

池承燈，施清涼，陳紫紅，陳繼承*

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

目的：利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲輔助提取禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩工藝。方法：以α-三聯(lián)噻吩提取率為考察指標(biāo)，選擇超聲功率、時間和提取溫度為隨機(jī)因子，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計，分析3個因素對響應(yīng)值的影響。結(jié)果：超聲輔助提取禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩的最佳提取功率350W；超聲時間42min；超聲處理溫度41℃。該條件下α-三聯(lián)噻吩的預(yù)測值86.5%，驗證值85.1%，理論的相對誤差為1.6%。結(jié)論：該優(yōu)化條件可行，為提高禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻提取率提供理論依據(jù)。

α-三聯(lián)噻吩，禹州漏蘆，提取，超聲輔助

禹州漏蘆為菊科藍(lán)刺頭屬植物藍(lán)刺頭（Echinops sphaerocephalus L）的干燥根，味苦、性寒，具有清熱解毒、舒筋通脈的功效[1]。α-三聯(lián)噻吩是禹州漏蘆中主要活性成分之一，由3個噻吩環(huán)通過α-碳原子連接的對稱結(jié)構(gòu)[2]，其對微生物、病蟲害、人體血紅蛋白等具有光促作用[3]。同時，α-三聯(lián)噻吩在長波紫外光照射下有保肝、抗炎、抗腫瘤、抗HIV[4-7]等作用。深入研究開發(fā)禹州漏蘆中脂溶性成分，特別是噻吩類物質(zhì)，是研究熱點(diǎn)之一。

目前，α-三聯(lián)噻吩的研究主要集中在其光敏性和光活化性質(zhì)，關(guān)于提取工藝的研究報道較少。傳統(tǒng)的冷浸法[8]、水浴回流提取法[9]提取α-三聯(lián)噻吩操作較為方便，但提取率較低；超臨界CO2萃取技術(shù)的應(yīng)用不會破壞α-三聯(lián)噻吩有效成分，且能顯著提高其提 取 率[10]，但 由 于CO2是 非 極 性 物 質(zhì) ，對 極 性 較 強(qiáng) 的物質(zhì)溶解能力較低，故超臨界CO2萃取技術(shù)具有一定局限性。超聲波輔助提取技術(shù)不僅提取率高、速度快，且不改變有效成分的結(jié)構(gòu)[11]。與傳統(tǒng)的溶劑提取法相比，超聲波輔助提取法不僅能節(jié)省能耗，且能有效提高活性成分的提取率。此外，還具有操作簡單、有效成分分離簡單等特點(diǎn)。因此，本文采用超聲波輔助提取法和HPLC分析法結(jié)合研究禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩的提取工藝，在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計，響應(yīng)面法優(yōu)化禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩的提取工藝，以期得到最佳的α-三聯(lián)噻吩提取工藝，為深入開發(fā)利用禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩提供理論性指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

禹州漏蘆 河北保定；α-三聯(lián)噻吩（純度99%）Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純、分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮、三氟乙酸 均為分析純。

Eppendorf 5415 R臺式離心機(jī) 德國Ep-pendorf公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津；KQ-500DE雙頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BS210S型電子分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司；FW135型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰師特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 樣品制備和溶劑選擇

1.2.1.1 樣品制備 將禹州漏蘆粉碎，過100目篩，25℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 溶劑選擇 稱取1g禹州漏蘆粉末于棕色具塞三角瓶，分別以20mL氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮和混合提取劑（丙酮和甲醇不同比例混合）作為提取溶劑，超聲波輔助提取30min，提取溫度40℃，超聲功率300W。取2mL于離心管中，10000r/min離心10min，取上清液，0.22μm有機(jī)膜濾膜過濾，在相

同色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測分析。

1.2.2 色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

1.2.2.1 色譜條件 檢測波長為350nm；流動相為甲醇∶0.1%三氟乙酸（9∶1，v/v）；流速為0.8mL/min，等梯度洗脫；進(jìn)樣量8μL，柱溫為30℃。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立 準(zhǔn)確稱取α-三聯(lián)噻吩對照品，用丙酮和甲醇混合液（7∶3，v/v）溶解，配制成0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲存?zhèn)溆茫⑾♂尦刹煌臐舛?，分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL，根據(jù)α-三聯(lián)噻吩不同濃度與對應(yīng)的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3 α-三聯(lián)噻吩提取率計算 吸取提取液進(jìn)行HPLC分析，按下列公式計算α-三聯(lián)噻吩的提取率：

式中：Y為α-三聯(lián)噻吩的提取率，%；m為8μL提取液含有α-三聯(lián)噻吩的質(zhì)量，μg；V為提取液的體積，mL；M為禹州漏蘆樣品中α-三聯(lián)噻吩總量，mg。

1.2.4 單因素實(shí)驗

1.2.4.1 料液比對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 稱取1.5g樣品粉末于棕色具塞三角瓶，加入丙酮和甲醇混合提取劑，按不同料液比（1∶3、1∶7、1∶15、1∶20和1∶25g/mL）溶解，超聲功率300W，超聲時間30min，提取溫度為40℃。

1.2.4.2 提取次數(shù)對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 稱取1.5g樣品粉末于棕色具塞三角瓶，20mL丙酮和甲醇混合液溶解，超聲功率300W超聲時間30min，提取溫度為40℃，考察不同超聲輔助提取次數(shù)（1、2、3、4和5次）的影響。

1.2.4.3 超聲功率對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 稱取1.5g樣品粉末于棕色具塞三角瓶，20mL丙酮和甲醇混合液溶解，超聲時間30min，提取溫度為40℃，考察不同超聲功率（250、300、350、400和450W）的影響。

1.2.4.4 超聲時間對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 稱取1.5g樣品粉末于棕色具塞三角瓶，20mL丙酮和甲醇混合液溶解，超聲功率300W，提取溫度為40℃?？疾觳煌晻r間（10、20、30、40和50min）的影響。

1.2.4.5 超聲溫度對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 稱取1.5g樣品粉末于棕色具塞三角瓶，20mL丙酮和甲醇混合液溶解，超聲功率300W，超聲時間30min?？疾觳煌崛囟龋?0、35、40、45和50℃）的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗 在單因素實(shí)驗基礎(chǔ)上，選擇對α-三聯(lián)噻吩提取影響比較大的三個因素進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken的中心組合設(shè)計，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化α-三聯(lián)噻吩的超聲輔助提取條件，實(shí)驗設(shè)計因子和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

分別以氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮和混合提取劑（丙酮和甲醇）作為提取溶劑，超聲波輔助提取，HPLC檢測分析。結(jié)果表明：以石油醚為提取溶劑時樣品峰較差且提取率較低；而以氯仿、乙酸乙酯、甲醇和丙酮作為提取溶劑時能較好檢測α-三聯(lián)噻吩。但α-三聯(lián)噻吩易溶于丙酮、氯仿，微溶于甲醇，若以純甲醇、氯仿為提取溶劑時提取率較低，以丙酮和甲醇混合液（7∶3，v/v）為提取溶劑，α-三聯(lián)噻吩的提取率顯著高于其他溶劑，故本文以丙酮和甲醇混合液（7∶3，v/v）為提取溶劑，能提高禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩的提取率。

表2 不同溶劑的提取結(jié)果Table 2 The extraction resuLts in different solvents

2.2 色譜條件

為了獲得較好的分離度，對流動相的溶劑體系進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)對流動相的組成、配比、流速和柱溫等優(yōu)化，最佳檢測條件為：檢測波長350nm；流動相為甲醇∶0.1%三氟乙酸（9∶1，v/v）；流速為0.8mL/min，等梯度洗脫；進(jìn)樣量8μL，柱溫為30℃。

圖1 α-三聯(lián)噻吩檢測的液相圖譜Fig.1 The HPLC chromatograms of α-terthienyl

從圖1中可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的目標(biāo)峰峰形良好，檢測到α-三聯(lián)噻吩的保留時間均為8.47min左右，說明該檢測方法能有效檢測α-三聯(lián)噻吩。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用外標(biāo)法，以檢測響應(yīng)值A(chǔ)rea（A）為縱坐標(biāo)、以不同濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到α-三聯(lián)噻吩的線性回歸曲線為：y=1034314.79x-31367.1（r=0.9999）。由線性相關(guān)系數(shù)可知，濃度在0.05~0.25mg/mL檢測范圍內(nèi)線性良好。

2.4 單因素實(shí)驗各個因子對提取率的影響

2.4.1 料液比對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 由圖2可知，料液比在1∶3~1∶20段，α-三聯(lián)噻吩提取率顯著提高，而1∶20~1∶25段沒有顯著性差異。這是由于α-三聯(lián)噻吩在較小料液比時，提取溶劑中α-三聯(lián)噻吩濃度較小，而禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩含量較高，兩個體系有較大傳質(zhì)動力，故在1∶3~1∶20段隨液料比的減小提取率增大；隨著α-三聯(lián)噻吩提取量的增大，提取率趨于平緩。因此選擇合適料液比為1∶20。

圖2 料液比對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of α-terthienyl

2.4.2 提取次數(shù)對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 從圖3可知，隨超聲輔助提取α-三聯(lián)噻吩次數(shù)增加，α-三聯(lián)噻吩的提取率增加，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次后，α-三聯(lián)噻吩提取率沒有顯著性差異。因此，綜合經(jīng)濟(jì)效益和提取率，最佳提取次數(shù)為3次。

2.4.3 超聲時間對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 由圖4可知，α-三聯(lián)噻吩的提取率隨時間的增加而增加，差異性顯著。當(dāng)時間大于40min時，α-三聯(lián)噻吩的提取率開始下降。這可能是由于α-三聯(lián)噻吩的易揮發(fā)性質(zhì)，隨著超聲處理時間的增加，α-三聯(lián)噻吩的揮發(fā)量也相應(yīng)增大[12]。另外，長時間的超聲輔助處理可能使α-三聯(lián)噻吩結(jié)構(gòu)破壞[13]。因此較優(yōu)超聲處理時間為40min。

圖4 超聲時間對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of α-terthienyl

圖5 超聲溫度對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on the yield of α-terthienyl

2.4.4 提取溫度對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 從圖5可知，35~40℃段，α-三聯(lián)噻吩的提取率差異顯著，α-三聯(lián)噻吩的提取率隨溫度的升高而增大，在40℃達(dá)到最大值，40~50℃提取率下降。這可能是由于溫度升高促進(jìn)α-三聯(lián)噻吩在溶劑中的溶解量，但由于α-三聯(lián)噻吩具有揮發(fā)性，隨著溫度升高其揮發(fā)量也將逐步增加，或是α-三聯(lián)噻吩在較高溫度下分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，發(fā)生降解，使得提取率不再增加，甚至減小[12-13]。因此，為獲取較高提取率選擇提取溫度為40℃。

2.4.5 超聲功率對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響 由圖6可知，超聲波功率達(dá)到350W前，α-三聯(lián)噻吩的提取率差異性顯著，其隨著超聲功率的增大而升高。當(dāng)超聲功率大于350W時，α-三聯(lián)噻吩的提取率開始有下降趨勢，這可能是α-三聯(lián)噻吩的揮發(fā)量大于其在溶劑中的溶解量，或是隨著超聲波功率的增大，α-三聯(lián) 噻吩 分 子 受 破 壞增 加[13]，故 此α-三聯(lián) 噻 吩 提 取 率下降。為節(jié)省能耗，選擇超聲波功率為350W。

圖6 超聲功率對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響Fig.6 Effect of uLtrasonic power on the yield of α-terthienyl

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化α-三聯(lián)噻吩的超聲波提取條件

在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上，以超聲功率、超聲時間和提取溫度為自變量，以α-三聯(lián)噻吩提取率為響應(yīng)值，分別以-1、0和1代表對應(yīng)變量的水平，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗。實(shí)驗方案和結(jié)果如表3。

表3 Box-Behnken中心組合設(shè)計方案及實(shí)驗結(jié)果Table 3 Box-Behnken experiments design and the resuLts of these experiments

利用Design expert 8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表4。同時對所得的實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到α-三聯(lián)噻吩的提取率（Y）對超聲處 理時間（X1）、超聲功率（X2）和提取溫度（X3）的二次多項回歸方程：

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for the regression response surface model

由表4的回歸模型方差分析結(jié)果可知，方程回歸高度顯著（p＜0.0001）。模型校正系數(shù)R2=0.9973和模型修正相關(guān)系數(shù)Radj=0.9939，且失擬項不顯著（p=0.0935＞0.05），表明該模型擬合度高，能較好地描述實(shí)驗結(jié)果，使用該方程代替真實(shí)的實(shí)驗點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗分析可行。

圖7直觀地反映了各因素交互作用的3D響應(yīng)曲面圖和等高線分析圖。由等高線分析圖可知，存在的極值就是等高線分析圖最小橢圓的圓心。結(jié)合表4的方差分析結(jié)果可知：超聲功率、超聲時間和提取溫度對α-三聯(lián)噻吩的提取率有極顯著影響，在較短時間超聲處理、較小超聲功率和較低提取溫度下α-三聯(lián)噻吩的提取率較低，隨著超聲時間、超聲功率和提取溫度的適當(dāng)增加可提高α-三聯(lián)噻吩的提取率。

圖7 不同因素交互響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Responsive surface and contours of different factors

由Design-Expert 8.0軟件確立最大響應(yīng)值（Y）時的編碼值X1、X2和X3分別為：X1=0.183、X2=0.248和X3= 0.108。與其對應(yīng)的α-三聯(lián)噻吩最佳提取條件為：超聲時間41.8min、超聲功率362.4W、提取溫度40.5℃，理論最佳提取率為86.5%。

2.6 驗證實(shí)驗

考慮實(shí)際操作，確定α-三聯(lián)噻吩的最佳工藝為：超聲功率350W，超聲時間42min，超聲處理溫度41℃。在此條件下進(jìn)行3次平行驗證實(shí)驗，得到三聯(lián)噻吩的平均提取率為85.1%，與理論預(yù)測值相差1.4%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝是可行的。

3 結(jié)論

以氯仿、石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和混合提取劑（丙酮和甲醇不同比例混合）作為提取溶劑，對比分析了禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩提取率差異，結(jié)果表明以混合提取溶劑時α-三聯(lián)噻吩提取率較高，能顯著提高α-三聯(lián)噻吩的提取率。

研究了料液比、超聲功率、時間和提取溫度等單因素對α-三聯(lián)噻吩提取率的影響。在單因素基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化，得到α-三聯(lián)噻吩提取工藝的最佳參數(shù)組合為：超聲功率350W；超聲時間42min；提取溫度41℃；在該條件下α-三聯(lián)噻吩的驗證值為85.1%，預(yù)測值為86.5%，兩者擬合度較高。實(shí)驗結(jié)果表明，在該優(yōu)化工藝條件下能實(shí)現(xiàn)較好地對禹州漏蘆中α-三聯(lián)噻吩進(jìn)行提取，為α-三聯(lián)噻吩的進(jìn)一步研究應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會. 中國藥典[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：244.

[2]金文榮. 華東藍(lán)刺頭化學(xué)成分及其生物活性研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2008.

[3] 汪毅，李銑，孟大利，等. 禹州漏蘆中噻吩類的化學(xué)成分[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008，25（3）：194-196.

[4]Lin C C，Yen M H，Chiu H F，et al.The pharmacological and pathological studies on Taiwan folk medicine（IV）：The effects of echinops grijisii and e.Latifoliu[J].The American journal of Chinese medicine，1990，18（3-4）：113-120.

[5]Lin C C，Lin C，Chiu H F，et al.The Pharmacological and pathological studies on taiwan folk medicine（VII）：The antiinflammatory effect of echinops grjiisii[J].The American Journal of Chinese Medicine，1992，20（2）：127-134.

[6]Ebermann R，Alth G，Kreitner M，et al.Natural products derived from plants as potential drugs for the photodynamic destruction of tumor cells[J].Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，1996，36（2）：95-97.

[7]Hudson J B，Harris L，Teeple A，et al.The anti-HIV activity of the phytochemical α -terthienyl[J].Antiviral Research，1993，20（1）：33-43.

[8]王玉健，胡林，徐漢虹.植物中α-三聯(lián)噻吩的熒光分光光度法檢測[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005（1）：73-75.

[9]張凱.黃頂菊中噻吩類和酚酸類物質(zhì)的研究[D]. 北京：北京化工大學(xué)，2011.

[10] 段洪良，楊文玲，劉紅梅，等. 超臨界CO2萃取禹州漏 蘆抗腫瘤有效 成分的 工藝 研 究[J]. 食品工 業(yè) 科技，2009，30（8）：259-260，263.

[11]Lai F，Wen Q，Li L，et al.Antioxidant activities of watersoluble polysaccharide extracted from mung bean（Vigna radiata L.） huLl with uLtrasonic assisted treatment[J].Carbohydrate Polymers，2010，81（2）：323-329.

[12]果德安，樓之岑，劉治安.華東藍(lán)刺頭根揮發(fā)油成分的研究[J]. 中國中藥雜志，1994，19（2）：100-101.

[13]段增賓. 微波場強(qiáng)化中草藥提取的傳質(zhì)機(jī)理研究[D]. 天津：天津大學(xué)，2005.

Optimization of ultrasonic-assisted extraction of α-terthienyl

CHI Cheng-deng，SHI Qing-liang，CHEN Zi-hong，CHEN Ji-cheng*
（College of Food Science，F(xiàn)ujiang Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Objective：To optimize the ultrasonic-assisted extraction conditions of α-terthienyl in Radix Echinopsis by the response surface analysis methodology.Methods：The yield of α-terthienyl was selected as investigation index，choosing the power of ultrasonic，extraction temperature and extraction time as random factors，and three-factors-three-levels Box-Behnken central composition designed to investigate the effect on the yield of α -terthienyl.Results：The optimal conditions were ultrasonic power of 350W，extraction time of 42min and extraction temperature of 41℃.Under these conditions，the predicted value of 86.5%was inosculated with the actual value of 85.1%.The relative error was only 1.6%.Conclusion：These methods were feasible for optimizing extraction processing and would efficiently improve the extractions of α-terthienyl in Radix Echinopsis.

α-terthienyl；Radix Echinopsis；extraction；ultrasonic-assisted

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0273-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.051

2014－02－24

池承燈（1991-），男，大學(xué)本科，研究方向：食品科學(xué)與工程專業(yè)。

* 通訊作者：陳繼承（1978-），男，博士，講師，研究方向：食品分析檢測、食品營養(yǎng)及功能性食品開發(fā)。