響應(yīng)面優(yōu)化桂花果實(shí)總黃酮超聲輔助提取工藝研究

陶阿麗，馮學(xué)花，曹殿潔，戴 一，尹 偉

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥 230088）

響應(yīng)面優(yōu)化桂花果實(shí)總黃酮超聲輔助提取工藝研究

陶阿麗，馮學(xué)花，曹殿潔，戴 一，尹 偉

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥 230088）

目的：響應(yīng)面法優(yōu)化桂花果實(shí)中總黃酮的超聲輔助提取工藝。方法：以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、液料比為自變量，總黃酮提取率作為因變量，通過(guò)對(duì)自變量各水平的多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合，用響應(yīng)面法優(yōu)選工藝。結(jié)果：確定最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為66%、超聲時(shí)間為26min、液料比為25mL/g，總黃酮提取率達(dá)6.99%。結(jié)論：響應(yīng)面法優(yōu)選桂花果實(shí)中總黃酮超聲輔助提取工藝，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠。

桂花果實(shí)，總黃酮，提取工藝，超聲輔助，響應(yīng)面法

桂 花（Osmanthus fragrans Lours.）為 木 犀 科 木 犀屬植物，為常綠喬木或灌木，原產(chǎn)于中國(guó)西南部。桂花果實(shí)是桂花的果實(shí)，俗稱桂子、桂花籽，每年3月開(kāi)始結(jié)果，4月中旬成熟，呈橢圓形或長(zhǎng)卵形狀，長(zhǎng)1.0～1.5cm，直徑0.7～0.9cm，表面為棕色或紫棕色，有隆起的不規(guī)則皺紋?！侗静菥V目》記載：桂花籽，味甘、辛，性溫，可化痰、生津、暖胃、平肝[1]。近年來(lái)，關(guān)于桂花中化學(xué)成分的研究報(bào)道較多，集中于桂花揮發(fā)油和黃酮類物質(zhì)的提取、分離及其在抗氧化、抑菌等方面的作用[2]。但是，對(duì)桂花果實(shí)中黃酮類物質(zhì)的研究少見(jiàn)報(bào)道[3-4]。

響 應(yīng) 面 法（Response Surface Methodology，RSM）可以快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件。近年來(lái)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)、食品、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及制藥等領(lǐng)域，與傳統(tǒng)的單變量?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)相比，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精度高等優(yōu)點(diǎn)[5]。

本實(shí)驗(yàn)利用超聲波可有效提高提取率的特點(diǎn)，以桂花果實(shí)總黃酮的提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)超聲輔助提取桂花果實(shí)總黃酮進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到桂花果實(shí)中總黃酮成分最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂花果實(shí) 采自安徽合肥大蜀山，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉金旗教授鑒定為金桂子，于2013年3月18日桂花果實(shí)皮為青綠色時(shí)開(kāi)始采摘，5d采摘1次，至桂花果實(shí)皮為紫黑色共采摘6次，采摘后60℃烘干，過(guò)40目篩備用；蘆丁對(duì)照品 中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，1198-101018；硝酸鋁、亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇等 均為分析純。

DZF-6020型真空干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；KQ118型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-4802S型紫外可見(jiàn)分光光度儀 尤尼柯儀器有限公司；FA2004型電子天平 上海良平儀器有限公司；FY130型粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10mg，置100mL燒杯中，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中定容，搖勻，即得0.20mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于25mL容量瓶中，加入70%的乙醇至10mL，加入5%亞硝酸鈉1.0mL，搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖 勻 ，放 置6min；加 入 1.0mol/L NaOH 溶 液10mL，加水至刻度，搖勻，放置15min。以不加蘆丁對(duì)照品溶液為空白，在510nm處測(cè)吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 總黃酮的超聲輔助提取 精確稱取1.0g桂花果實(shí)粉末，置于圓底燒瓶中。室溫條件下，用乙醇作為提取劑，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間三個(gè)因素，在不同條件下進(jìn)行超聲提取。提取后抽濾，吸取適量提取液測(cè)定黃酮含量。按照1.2.1方法，測(cè)定吸光度，按照下式計(jì)算總黃酮提取率[6]。

其中，C為提取液中總黃酮濃度（mg/mL），V為提取液體積（mL），m為桂花果實(shí)粉末質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)方法 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考慮三種因素對(duì)桂花果實(shí)總黃酮提取率的影響。

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 取適量桂花果實(shí)粉末，分別加40%、50%、60%、70%、80%乙醇，固定料液比為15∶1（mL/g）、超聲提取為30min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桂花果實(shí)總黃酮提取率的影響。

1.2.3.2 超聲時(shí)間的選擇 取適量桂花果實(shí)粉末，超聲提取時(shí)間分別為15、30、45、60、75min，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為15∶1（mL/g），考察不同超聲時(shí)間對(duì)桂花果實(shí)中總黃酮提取率的影響。

1.2.3.3 液料比的選擇 取適量桂花果實(shí)粉末，分別加溶劑10、15、20、25、30倍量，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲時(shí)間為為30min，考察不同液料比對(duì)桂花果實(shí)中總黃酮提取率的影響。

1.2.4 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定的各影響因素的適當(dāng)范圍，采用響應(yīng)面分析法，依據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)原理，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和液料比三個(gè)因素為自變量，以桂花果實(shí)總黃酮提取率為因變量，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件，進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)。分析因素與水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平安排表Table 1 Level and code of independent variable used for response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程

根據(jù)各濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的吸光度，計(jì)算得到線性相關(guān)系數(shù)R2=0.992，回歸方程為A=0.1105C-0.0298。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 準(zhǔn)確吸取蘆丁對(duì)照品溶液2.00mL于10mL容量瓶中，加一定量70%乙醇至5mL，加入5%NaNO20.3mL，搖勻，放置6min；再加入10% Al（NO3）3溶 液 0.3mL，搖 勻 ，放 置 6min；加 入 1.0mol/L NaOH溶液4mL，加水至刻度，搖勻，放置15min。以不加蘆丁對(duì)照品溶液為空白，在510nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)6次，RSD為1.32%，精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取桂花果實(shí)粉約1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇15mL，超聲提取30min，濾過(guò)得供試品。精密吸取1份供試品溶液2mL，按照1.2.1項(xiàng)下方法顯色，分別于間隔0、10、20、30、40、50、60min，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，1h內(nèi)吸光度值無(wú)明顯變化，RSD為1.17%，供試品溶液顯色后在1h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照2.2.2所述供試品溶液的制備方法，制備6份供試品溶液，分別按照1.2.1項(xiàng)下方法顯色測(cè)定吸光度，RSD為1.47%，此方法重復(fù)性良好。

表2 加樣回收率結(jié)果Table 2 Results of recovery test

2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照2.2.2所述供試品溶液的制備方法，制備6份供試品溶液，精密加入一定量對(duì)照品，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中定容，搖勻。按照1.2.1項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，平均回收率為98.95%，RSD為0.65%，具有良好的回收率。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桂花果實(shí)總黃酮提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～70%范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%以后，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而下降，這是由于黃酮類是一類極性范圍較廣的化合物，在70%的乙醇溶液中，黃酮類物質(zhì)能夠最大限度地溶出。而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)，水溶性黃酮溶出量開(kāi)始減少，而出現(xiàn)黃酮的提取率下降[7]。

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響 不同超聲時(shí)間對(duì)桂花果實(shí)中總黃酮提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮提取率先增加后降低，30min時(shí)提取率最高，為6.85%。其原因可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間超聲波空化作用破壞了黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致黃酮溶出減少[8]。

2.3.3 液料比對(duì)提取效果的影響 不同液料比對(duì)桂花果實(shí)中總黃酮提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著液料比的增加，總黃酮提取率增加。但是當(dāng)液料比達(dá)到20∶1（mL/g）之后，當(dāng)增加液料比時(shí)，總黃酮提取率的增加趨于緩慢，總黃酮的溶出基本達(dá)到最大。再繼續(xù)增加溶劑的用量，不僅不能增加總黃酮提取率，反而會(huì)增加成本[9]。因此，液料比選擇20∶1（mL/g）。

圖3 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

2.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時(shí)間（B）、液料比（C）設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以桂花果實(shí)總黃酮提取率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果Table 3 The response surface experimental design and results

采用Design-expert 8.0.5軟件對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得擬合方程：

Y=6.84-0.081A+0.37B+0.15C+0.64AB-0.32AC-0.55BC-0.67A2-0.92B2-0.028C2。作回歸方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，回歸模型高度顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng) 不 顯 著（p=0.2062＞0.05）以 及 R2=0.9858，Adeq Precision=23.961（遠(yuǎn)大于4），可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對(duì)桂花果實(shí)總黃酮的提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)。由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng)B（p=0.0002＜0.01）、一次項(xiàng)C（p=0.0254＜0.05）對(duì)黃酮提取的線性效應(yīng)顯著，一次項(xiàng)A（p=0.1598＞0.05）對(duì)提取率沒(méi)有顯著影響；二次項(xiàng)A2（p＜0.0001）、B2（p＜0.0001）對(duì)黃酮提取的曲面效應(yīng)極顯著，而C2（p=0.7010＞0.05）不顯著；交互項(xiàng)AB（p＜0.0001）、AC（p=0.0035＜0.01）、BC（p=0.0001＜0.01）都顯著；表明各影響因素對(duì)黃酮提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表4 響應(yīng)面分析法對(duì)果膠提取率的ANOVA分析結(jié)果Table 4 The response surface analysis of pectin extraction rate of ANOVA analysis results

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of total flavonoids

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

圖6 超聲時(shí)間和液料比對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

通過(guò)響應(yīng)面圖（圖4~圖6），能夠很直觀的觀察各因素以及各因素之間的關(guān)系。由圖4可以看出當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)約為66%、超聲時(shí)間約為27min時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大值，之后在最大值波動(dòng)。由圖5可以看出當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)約為66%、液料比約為25mL/g時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大值，之后在最大值波動(dòng)。由圖6可以看出當(dāng)超聲時(shí)間約為27min、液料比約為25mL/g時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大值，之后在最大值波動(dòng)。

優(yōu)化擬合方程，可得到模型的最大值，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為65.94%、超聲時(shí)間為26.48min、液料比為25mL/g時(shí)提取率達(dá)到最大值為7.061%?？紤]到實(shí)際操作性，對(duì)響應(yīng)面二次回歸所得最佳條件進(jìn)行修正，確定最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為66%、超聲時(shí)間為26min、液料比為25mL/g。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，根據(jù)上述修正后條件，同條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，得總黃酮提取率為6.99%。將所得實(shí)測(cè)值與二項(xiàng)式擬合方程預(yù)測(cè)的最大值進(jìn)行比較，計(jì)算偏差，結(jié)果平均偏差為1.51%，偏差較小，說(shuō)明該模型有效。

3 結(jié)論

通過(guò)采用中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析，得到桂花果實(shí)總黃酮提取工藝的二次多項(xiàng)回歸模型，模型擬合程度良好。優(yōu)化得到的桂花果實(shí)總黃酮提取最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為66%、超聲時(shí)間為26min、液料比25mL/g，響應(yīng)值（提取率）為6.99%。黃酮成分是桂花及桂花果實(shí)中所含的一類重要的成分，具有抗衰老、抗癌等多種藥理作用。研究桂花果實(shí)總黃酮的最佳提取工藝，對(duì)于其黃酮成分的深入研究提供一定的基礎(chǔ)，對(duì)于桂花保健食品的深度開(kāi)發(fā)具有重要的價(jià)值[10-11]。

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Optimizing ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from fruits of Osmanthus fragrans Lour.

TAO A-li，F(xiàn)ENG Xue-hua，CAO Dian-jie，DAI Yi，YIN Wei
（College of Pharmaceutical Sciences of Anhui Xinhua University，Hefei 230088，China）

Objective ： To optimize ultrasonic-assisted extraction techniques of total flavonoids from fruits of Osmanthus fragrans Lour.by using response surface method.Methods：Ethanol concentration，ultrasonic time and liquid-solid ratio served as independent variables while the total flavonoids served as the dependent variable.Based on multiple linear regression and binomial expression，central composite design and response surface method were employed to optimize the extracting process.Results ：The optimized extraction conditions were ethanol concentration （66% ） ，ultrasonic time （26min ） and liquid-solid ratio （25mL/g ） ，and affected the total amount of extraction（6.99% ）.Conclusion：The optimum process，simple in methodology，yet yields reliable results.

fruitsofOsmanthus fragrans Lour.；totalflavonoids；extractiontechnology；ultrosonic-assisted；response surface method

TS214.9

B

1002-0306（2014）22-0264-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.049

2014－04－22

陶阿麗（1983-），女，碩士研究生，講師，研究方向：基礎(chǔ)化學(xué)與天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)。

安徽新華學(xué)院校級(jí)精品課程（2012jpkcx07）。