油橄欖鮮果中總黃酮提取工藝優(yōu)化及其含量隨不同成熟度的變化

鄧俊琳，王寒冬，劉 露，丁春邦，*，李 天，楊澤身

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130；3.涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，四川西昌 615000）

油橄欖鮮果中總黃酮提取工藝優(yōu)化及其含量隨不同成熟度的變化

鄧俊琳1，王寒冬1，劉 露1，丁春邦1，*，李 天2，楊澤身3

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130；3.涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，四川西昌 615000）

以油橄欖鮮果為材料，采用響應(yīng)面法對超聲波輔助提取油橄欖總黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測定皮瓜爾、弗奧、克羅萊卡、卡林、鄂植、云臺、配多靈、科拉蒂八個品種的六個成熟度的總黃酮含量?；趩我蛩貙?shí)驗(yàn)，以料液比、甲醇濃度、超聲溫度和超聲時(shí)間為自變量，油橄欖總黃酮提取量為響應(yīng)值，確定最佳提取工藝條件：料液比1∶23（g/mL）、甲醇濃度80%、超聲溫度48℃、超聲時(shí)間30min，油橄欖鮮果總黃酮提取量為0.8567mg/g。八個油橄欖品種的總黃酮含量隨成熟度增加，呈現(xiàn)先下降后略有上升的變化趨勢，含量最高為克羅萊卡的第一成熟度3.9042mg/g，最低為云臺的第四成熟度0.7189mg/g，鄂植和配多靈從第三成熟度開始總黃酮含量顯著高于其他品種。

油橄欖，總黃酮，響應(yīng)曲面法，超聲波輔助，成熟度

油 橄欖（Olea europaea L.）又 名 洋 橄 欖 、齊 墩 果 ，屬 木 犀 科 木 犀 欖 屬 植 物 ，為 世 界 四 大 木 本 油 料 作 物之一。主要分布于地中海沿岸地區(qū)，后經(jīng)引種廣泛栽植于我國甘肅南部、四川西南部、云南西北部金沙江流域等地[1]。油橄欖是一種高經(jīng)濟(jì)效益的樹種，橄欖果既可生產(chǎn)食用油又可加工成餐用油，榨油后的果渣可作飼料、肥料或燃料，嫩枝梢和葉可做茶[2]。油橄欖的主產(chǎn)品——橄欖油含有大量的不飽和脂肪酸和多種酚酸類、黃酮類、維生素及色素類生物活性成分[3]，具有促進(jìn)骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老等多種功能，因而有“食用植物油皇后”的美譽(yù)[4]。研究表明，橄欖油中的黃酮類化物質(zhì)具有抗氧化、抗菌、抗病毒、防癌抗癌等多種生物活性功能，其含量與橄欖油品質(zhì)有著密切的聯(lián)系[5-7]。

目前，國內(nèi)外提取植物黃酮類化合物的方法較多，如溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、雙水相萃取分離法、半仿生提取法等[8]。油橄欖果中黃酮類化合物的提取多采用 溶劑 浸提 法[9-10]，但 該 法 存 在 溶 劑 消 耗 多 、提 取 時(shí)間長、提取效率低、成本高等缺陷[5]。超聲波提取法利用超聲波在液體中強(qiáng)烈的空化作用加速植物有效成分的浸出，具有操作簡便、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于植物次生代謝產(chǎn)物的提取[11]。因此本實(shí)驗(yàn)采 用 響 應(yīng) 面 法（response surface methodology，RSM）對油橄欖果中總黃酮的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測定八個品種六個成熟度的總黃酮含量，以期為油橄欖果中黃酮類化合物的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油橄欖鮮果 2013年6～10月采自四川西昌的北河油橄欖基地，共選取八個品種六個成熟度，成熟度以 果 皮 、果 肉 色 澤 區(qū) 分[12]，冷 凍 儲 存 備 用 ；蘆 丁 成都市科龍化工試劑廠；甲醇、三氯化鋁 均為分析純。

BT-124S電子天平 德國Sartorius公司；RM-220實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī) 四川沃特爾科技發(fā)展有限公司；KQ-300GDV恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī) 德國Thermo公司；UV-1750分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油橄欖果中總黃酮提取量的測定 總黃酮提取 量 的 測 定 采 用 AlCl3顯 色 法[13]，稍 加 改 動 ：取 待 測液400μL，加2mL甲醇，搖勻，再加1.6mL AlCl3試劑搖勻，靜置10min，于415nm檢測吸光值。以蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.0038X-0.0035：（R2=0.9992，線性范圍50~250μg/mL）。

總黃酮提取量（mg/g）=樣品液中總黃酮質(zhì)量濃度×樣品液體積×稀釋倍數(shù)/初始油橄欖粉末質(zhì)量/ 1000。

1.2.2 油橄欖果中總黃酮的提取 將冷凍的油橄欖果實(shí)去核，加液氮研成粉末，準(zhǔn)確稱取0.5g粉末，加甲醇超聲波浸提，離心，收集上清液，定容，按1.2.1方法測定并計(jì)算總黃酮提取量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以第二成熟度的皮瓜爾為研究材料，油橄欖果總黃酮提取量為指標(biāo)，研究料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，固定甲醇濃度100%，超聲溫度40℃，時(shí)間30min）、甲醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%，固定料液比1∶20，超聲溫度40℃，時(shí)間30min）、超聲溫度（30、40、50、60、70℃，固定料液比1 ∶10，甲 醇 濃 度 100% ，超 聲 時(shí) 間30min）、超 聲 時(shí) 間（10、20、30、40、50min，固 定 料 液 比 1 ∶10，甲 醇 濃 度 100%，超聲溫度50℃）對總黃酮提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以料液比（A）、甲醇濃度（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）為自變量，以油橄欖果中總黃酮提取量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平表，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 不同成熟度果實(shí)的總黃酮含量測定 測定八個品種六個成熟度的總黃酮含量，初步探討油橄欖果實(shí)中總黃酮含量在不同成熟階段的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，應(yīng)運(yùn)Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0、Design expert 8.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對油橄欖總黃酮提取量的影響 總黃酮提取量隨溶劑量的增加而增加，當(dāng)料液比1∶20時(shí)提取量達(dá)到0.74775mg/g，之后溶劑量繼續(xù)增大，提取量增加緩慢，這可能是由于細(xì)胞中有效成分已基本溶出，即使溶劑量增大，對提取量無明顯影響（圖1）。為節(jié)省提取溶劑的角度考慮，將優(yōu)化料液比選定為1∶10、1∶20、1∶30。

圖1 料液比對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2 甲醇濃度對油橄欖果總黃酮提取量的影響總黃酮提取量隨甲醇濃度的增大逐漸增加，當(dāng)甲醇濃度為60%時(shí)，提取量達(dá)最大0.8606mg/g，濃度繼續(xù)增加，提取量反而下降，這可能是由于甲醇濃度過高，脂溶性物質(zhì)大量溶出，導(dǎo)致黃酮類化合物提取量下降（圖2）。因此選擇甲醇濃度40%、60%、80%作響應(yīng)面分析。

圖2 甲醇濃度對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.3 超聲溫度對油橄欖果總黃酮提取量的影響隨著提取溫度的升高，總黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)提取溫度到達(dá)40℃時(shí)，提取量達(dá)最大值0.6444mg/g，溫度升高增加溶劑分子和溶質(zhì)分子的運(yùn)動，促進(jìn)擴(kuò)散，利于總黃酮的溶出[14]；但溫度繼續(xù)升高時(shí)，總黃酮提取量反而下降，可能由于溫度過高，造成總黃酮化合物的降解，導(dǎo)致提取量下降（圖3）。所以優(yōu)化提取溫度選擇30、40、50℃。

圖3 超聲溫度對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids

2.1.4 超聲時(shí)間對總黃酮提取量的影響 隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮提取量先增大后減小，時(shí)間為30min時(shí)，提取量達(dá)最大值0.5816mg/g，這可能是由于超聲時(shí)間延長，總黃酮溶出量增加，當(dāng)細(xì)胞中有效成分基本全部溶出時(shí)，提取量不再增加；提取時(shí)間繼續(xù)延長，提取量反而下降，這可能是由于超聲時(shí)間過長，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致總黃酮提取量下降[15]（圖4）。因此將優(yōu)化時(shí)間設(shè)定為20、30、40min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化油橄欖果總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)表2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用design expert 8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得模型表達(dá)式：

圖4 超聲時(shí)間對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

對 該 模 型 采 用 方 差 分 析（analysis of variance，ANOVA），分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示模型極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），相關(guān)系數(shù)R2=0.9493，說明該模型對實(shí)驗(yàn)擬合度較好，可用于油橄欖果總黃酮提取實(shí)驗(yàn)的預(yù)測。另外，該模型的變異系數(shù)C.V為5.14%，在可接受范圍內(nèi)。A、B、C、A2、C2、D2影響極顯著，D、BD、CD影響顯著，表明各實(shí)驗(yàn)因素對總黃酮提取量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 響應(yīng)面回歸方程的方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖5 超聲時(shí)間和甲醇濃度對總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of ultrasonic time and methanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

圖6 超聲時(shí)間和超聲溫度對總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程，做出交互項(xiàng)顯著的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，如圖5、圖6所示。等高線的形狀可以反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表明交互作用顯著，而圓形則與之相反，有閉合的橢圓或圓形則表明有極大值[16]。通過方差分析及響應(yīng)面分析可知，在本實(shí)驗(yàn)中，料液比和甲醇濃度是影響油橄欖總黃酮提取的最重要的兩個因素，次之是超聲溫度，超聲時(shí)間影響最小；甲醇濃度、超聲溫度分別與超聲時(shí)間的交互作用對油橄欖總黃酮提取量的影響顯著，而其他因素的交互作用不顯著。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 依據(jù)回歸模型，確定超聲波輔助提取油橄欖果總黃酮的最佳條件為料液比1∶22.92（g/mL）、甲醇濃度80%、溫度47.95℃、時(shí)間29.73min，在此條件下，預(yù)測油橄欖鮮果總黃酮提取量達(dá)0.8616mg/g。

為了檢測真實(shí)值是否與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值一致，根據(jù)得到的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修改為料液比1∶23（g/mL）、甲醇濃度80%、超聲溫度48℃，超聲時(shí)間30min，在此條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測得的總黃酮提取量的平均值為0.8567mg/g，其相對誤差約為0.57%，與理論預(yù)測值相接近，表明建立的模型可以較好地模擬和預(yù)測油橄欖總黃酮的提取效果。

2.3 不同成熟度的油橄欖果中總黃酮含量的變化

由圖7可知，油橄欖果實(shí)隨成熟度的增加，其總黃酮含量呈現(xiàn)先下降后略有上升的變化趨勢，這與桑葚[17]和蘋果[18-19]中的研究結(jié)果相似。在整個成熟過程中，第一成熟度的總黃酮含量均為最高，第四、五成熟度時(shí)含量降至最低，第六成熟度略有上升；總黃酮含量最高為克羅萊卡的第一成熟度3.9042mg/g，最低為云臺的第四成熟度0.7189mg/g；變化幅度最大為克羅萊卡3.1739mg/g，最小為配多靈0.8533mg/g；鄂植和配多靈的總黃酮含量從第三成熟度開始均顯著高于其他品種，第四成熟度時(shí)含量達(dá)最低，分別為1.4736mg/g和1.2831mg/g。植物黃酮類生物合成的直接前體物質(zhì)為丙二酸單酰、香豆酰，而這兩種前體分別與糖代謝、脂質(zhì)代謝以及氨基酸代謝有關(guān)[20]，這可能是導(dǎo)致總黃酮含量在油橄欖成熟過程中大量下降的主要原因。油橄欖果實(shí)在成熟過程中，果皮顏色由青綠轉(zhuǎn)為黃綠，再變成少半紫、多半紫、全紫直至黑紫，果肉顏色由綠轉(zhuǎn)為黃綠、白色、少半紫、多半紫、全紫?；ㄉ疹愇镔|(zhì)的合成受類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）的催化，研究發(fā)現(xiàn)UFGT酶在草莓果實(shí)發(fā)育的全紅期活性較高[21]。由此推測，油橄欖果皮和果肉轉(zhuǎn)紫過程中總黃酮含量略有增加，也可能與花色苷類物質(zhì)的合成有關(guān)。油橄欖果中黃酮類化合物的積累、轉(zhuǎn)化、降解是一個復(fù)雜的過程，其機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究。

圖7 油橄欖不同品種果實(shí)中總黃酮提取量隨成熟度的變化Fig.7 Changes in the extraction yield on total flavonoids of olive fruits during ripening stages

3 結(jié)論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油橄欖鮮果總黃酮提取量隨著甲醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而隨著料液比的增大，呈現(xiàn)為先升高后趨于平穩(wěn)。

3.2 通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并結(jié)合響應(yīng)面分析進(jìn)行提取優(yōu)化，得到最佳提取工藝為料液比1∶23（g/mL）、甲醇濃度80%、超聲溫度48℃，超聲時(shí)間30min，在此條件下，油橄欖鮮果總黃酮提取量可達(dá)0.8567mg/g。

3.3 在整個成熟過程中，油橄欖果實(shí)總黃酮含量呈現(xiàn)先下降后略有上升的變化趨勢；總黃酮含量最高為克羅萊卡的第一成熟度3.9042mg/g，最低為云臺的第四成熟度0.7189mg/g；鄂植和配多靈從第三成熟度開始總黃酮含量顯著高于其他品種，第四成熟度時(shí)達(dá)最低，分別為1.4736mg/g和1.2831mg/g。

[1] 鄧明全，俞寧. 油橄欖引種栽培技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：10-16.

[2] 徐緯英，王賀春. 油橄欖及其栽培技術(shù)[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2004：13-14.

[3]Dagˇdelen A，Tümen G，?zcan M M，et al.Phenolics profiles of olive fruits（Olea europaea L.） and oils from Ayval?k，Domat and Gemlik varieties at different ripening stages[J].Food Chemistry，2013，136（1）：41-45.

[4] 于長青.橄欖油的化學(xué)組成及對 人體的營養(yǎng) 價(jià)值[J]. 食品科技，2000（2）：59-60.

[5] 李楠，劉元，侯濱濱.黃 酮類化合物 的功能特性[J]. 食品研究與開發(fā)，2005，26（6）：139-141.

[6]Hay M E.Marine chemical ecology：what’s known and what’s next?[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，1996，200（1）：103-134.

[7]Yang D P，Kong D X，Zhang H Y.Multiple pharmacological effects of olive oil phenols[J].Food Chemistry，2007，104（3）：1269-1271.

[8]李鳳林，李青旺，馮彩寧，等.天然黃酮類化合物提取方法研究進(jìn)展[J]. 中國食品添加劑，2008（5）：60-64.

[9]Baccouri O，Guerfel M，Baccouri B，et al.Chemical composition and oxidative stability of Tunisian monovarietal virgin olive oils with regard to fruit ripening[J].Food Chemistry，2008，109（4）：743-754.

[10]Gómez-Rico A ，F(xiàn)regapane G ，Salvador M D.Effect of cultivar and ripening on minor components in Spanish olive fruits and their corresponding virgin olive oils[J].Food Research International，2008，41（4）：433-440.

[11] 項(xiàng)昭保，霍丹群，任紹.超聲波在中草藥化學(xué)成分提取中的應(yīng)用[J]. 自然雜志，2001，2（5）：289-291.

[12]Salvador M D，Aranda F，F(xiàn)regapane G.Influence of fruit ripening on‘Cornicabra’virgin olive oil quality A study of four successive crop seasons[J].Food Chemistry，2001，73（1）：45-53.

[13] 鄭媛媛，李辰，封士蘭.油橄欖葉中總黃酮含量測定方法探討[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2011，31（2）：547-550.

[14] 薛治浦，李欣，朱文學(xué).響應(yīng)面法優(yōu)化丹參葉總酚酸超聲波輔助提取工藝[J]. 食品科學(xué)，2011，32（12）：34-38.

[15] 王振宇，周芳，趙鑫.響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取大果沙棘總黃酮工藝[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2007，7（6）：44-51.

[16]普義鑫，周文化，蔣愛民，等.響應(yīng)面法優(yōu)化檳榔中多酚提取工藝條件的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，26（12）：334-338.

[17] 王振江，羅國慶，唐翠明，等.桑葚成熟過程中酚類物質(zhì)、總黃酮及花色苷含量的動態(tài)變化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（9）：1658-1660.

[18]Lister C E，Lancaster J E，Sutton K H，et al.Developmental changes in the concentration and composition of flavonoids in skin of a red and a green apple cultivar[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，1994，64（2）：155-161.

[29]Awad M A，de Jager A，van der Plas L H W，et al.Flavonoid and chlorogenic acid changes in skin of‘Elstar’and‘Jonagold’apples during development and ripening[J].Scientia Horticulturae，2001，90（1）：69-83.

[20]張華峰，王瑛，黃宏文.黃酮類化合物生物合成途徑的進(jìn)化及其在淫羊藿中的研究展望[J].中草藥，2006，37（11）：1745-1751.

[21]Halbwirth H，Puhl I，Haas U，et al.Two-phase flavonoid formation in developing strawberry（Fragaria×ananassa） fruit[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（4）：1479-1485.

Optimization of extraction for total flavonoids from olive fruit and its changes at different ripening stages

DENG Jun-lin1，WANG Han-dong1，LIU Lu1，DING Chun-bang1，*，LI Tian2，YANG Ze-shen3
（1.College of Life and Basic Sciences，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Liangshan Zhongze New Tech Development Co.，Ltd.，Xichang 615000，China）

Response surface methodology was employed to optimize the extraction process of total flavonoids in fresh olive fruit assisted by ultrasonic.And the contents of total flavonoids in picual，frantoio，koroneiki，kaliniot，ezhi，yuntai，pendolino and coratina with six maturities were measured.The aim of the extraction process was to examine the extraction parameters such as solid-liquid ratio，methanol concentration，ultrasonic temperature and ultrasound time，and to obtain the best possible combinations of these parameters for maximizing extraction yield of total flavonoids through response surface methodology （RSM） on the basis of single factor experiments.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows ： solid-liquid ratio 1∶23（g/mL），methanol concentration 80%，ultrasonic temperature 48℃，ultrasonic time 30min.Under this optimum condition，the yield of total flavonoids in olive fruit was 0.8567mg/g.The contents of total flavonoids in eight olive varieties with maturity increasing had slight increase after an initial decline.The highest yield of total flavonoids was ‘koroneiki’（3.9042mg/g） at the first maturity，and the lowest one was ‘yuntai’（0.7189mg/g） at the fourth maturity.The yield of total flavonoids in ezhi and coratina were significantly higher than other varieties after the third maturity.

olive；total flavonoids；response surface methodology（RSM）；ultrasonic-assisted；ripening stage

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.047

2014－03－11

鄧俊琳（1988-），女，碩士研究生，研究方向：油橄欖優(yōu)良品種選育。

* 通訊作者：丁春邦（1966-），女，教授，主要從事植物學(xué)教學(xué)與科研工作。

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013NZ0047）。