響應(yīng)面法優(yōu)化費菜多酚的提取工藝研究

周 文，強 毅，魯秀蘭，王喆之

（藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

響應(yīng)面法優(yōu)化費菜多酚的提取工藝研究

周 文，強 毅，魯秀蘭，王喆之*

（藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

目的：利用響應(yīng)面法對費菜中多酚物質(zhì)的提取條件進行優(yōu)化。方法：單因素實驗基礎(chǔ)上選取實驗因素與水平，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）實驗設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以費菜多酚物質(zhì)含量為響應(yīng)值作響應(yīng)面分析實驗。結(jié)果：在分析各個因素的顯著性和交互作用后，得出費菜多酚物質(zhì)浸提的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)67%，浸提溫度41℃，浸提時間2h，料液比1∶25（g/mL），以焦性沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，費菜多酚物質(zhì)一次提取含量可達60.90mg/g。結(jié)論：響應(yīng)曲面回歸方程與實驗結(jié)果擬合性好，此模型合理可靠，可用于實際預(yù)測。

費菜，多酚物質(zhì)，響應(yīng)面分析

費菜（Sedum aizoon Linn．）為景天科（Crassulaceae）景天屬（Sedum）多年生草本植物，以根及全草入藥，功類三七，故稱景天三七，又名六月淋、收丹皮、土三七等，是著名的秦嶺“太白七藥”之一，具有散瘀止血，安神，解毒之功效[1]，費菜莖葉可食，被收于明朝朱橚所著的《救荒本草》，作為野生蔬菜具有心血管保健的功效，被稱為養(yǎng)心草廣泛分布于我國陜西、四川、江蘇、湖北、山東、寧夏、甘肅等地[2]?，F(xiàn)代藥理研究和臨床證明費菜具有抗衰老、抗缺氧、抗疲勞及改善心腦血管系統(tǒng)和免疫調(diào)節(jié)作用[3-4]。

費菜中含有豐富的多酚類物質(zhì)，植物多酚為植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝物，主要存在于植物的皮、根、葉、果中，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[5-7]。許多實驗研究資料均顯示，植物多酚具有較強的清除自由基、抗氧化活性、抗腫瘤、抗輻射以及保護心血管系統(tǒng)等重要的生物活性功能。因此開發(fā)研究費菜多酚，對于其資源的充分利用具有積極意義，也是費菜經(jīng)濟效益的有效途徑[8-9]。

本文在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選用響應(yīng)面優(yōu)化法對費菜中多酚的提取進行了優(yōu)化，克服了傳統(tǒng)方法實驗組數(shù)多、實驗周期長的缺陷，以最經(jīng)濟的方式，對所選的實驗參數(shù)進行全面研究，以期為費菜的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費菜 采自陜西省西安市灞橋區(qū)，經(jīng)陜西師范大學(xué)田先華教授鑒定為景天科景天屬植物費菜，將其在30℃下恒溫干燥至恒重，粉碎并過40目篩，密封后于常溫下保存?zhèn)溆?；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，福林酚試劑，無水乙醇（分析純），無水碳酸鈉。

YB-1000A高速多功能粉碎機 天津市速峰有限公司；AT2201電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；101-2AB型鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；MLLI-Q超純水儀 美國Millipore公司；KH-700DB型數(shù)控超聲波清洗儀 昆山和創(chuàng)有限公司；SHZ-D臺式真空泵 鄭州長城有限公司；Epoch超微量微孔板分光光度計 美國BioTek公司。

1.2 多酚的測定

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[10-11]。精密稱取10.0mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，去離子水定容制成濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸母液，4℃存放。將沒食子酸對照品母液用水依次稀釋成濃度分別為80、60、40、20、15、10、5μg/mL的梯度溶液。分別取各梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液100μL于1.5mL EP管 中 ，向 每 支 EP 管 中 依 次 加 入 500μL Folin-Ciocalteu 試 劑 黑 暗 下 反 應(yīng) 8min，再 加 400μL Na2CO3（7.5%，W/V），混勻，40℃水浴30min。然后在765nm波長處測定反應(yīng)液的吸光值。實驗同時設(shè)空白對照，以去離子水代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液。實驗重復(fù)3次，以平均吸光度值為橫坐標(biāo)，以沒食子酸濃度為縱坐標(biāo)，得一元線性回歸方程。

1.2.2 多酚含量的測定 精確移取1mL多酚粗提液，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色，設(shè)計三組平行實驗，于最大吸收波長765nm處測吸光度并計算含量。費菜多酚的含量表示為每克干重樣品中含有的多酚量（以沒食子酸計，mg/g）。

1.3 單因素實驗

選用乙醇溶劑浸提法作為提取方法。對可能影響費菜多酚含量的幾個因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度）分別做單因素實驗，按照多酚的測定方法（Folin-Ciocalteau），移取待測提取液1mL于25mL容量瓶中，依次加入1.5mL Folin-Ciocalteau顯色劑及6mL 10%Na2CO3溶液并定容，反應(yīng)2h后，于波長765nm處測定吸光度，計算多酚含量。

1.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 準(zhǔn)確稱取1．00g預(yù)處理好的的材料，按料液比（g/mL）1∶20分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%和90%的乙醇溶液作為提取液于50mL三角瓶中，在40℃、40kHz避光超聲2h后，抽濾提取液，將濾液轉(zhuǎn)至20mL容量瓶，用60%乙醇定容?；靹蚝笕〕?.1mL置于100mL容量瓶中，立即測定其多酚含量。

1.3.2 料液比的確定 準(zhǔn)確稱取1．00g預(yù)處理好的的材料，按料液比（g/mL）1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35稱取材料于50mL三角瓶中，用60%乙醇，在40℃、40kHz避光超聲2h后，抽濾提取液，將濾液轉(zhuǎn)至20mL容量瓶?；靹蚝笕〕?.1mL于100mL容量瓶中，立即測定其多酚含量。

1.3.3 提取溫度的確定 準(zhǔn)確稱取1.00g預(yù)處理好的的材料，于50mL三角瓶中，按料液比（g/mL）1∶20加入60%乙醇20mL，充分搖勻后分別在溫度20、30、40、50、60、70℃下，40kHz避光超聲2h后，抽濾提取液，將濾液轉(zhuǎn)至20mL容量瓶。混勻后取出0.1mL于100mL容量瓶中，立即測定其多酚含量。

1.3.4 提取時間的確定 準(zhǔn)確稱取材料1.00g預(yù)處理好的的材料，于50mL三角瓶中，按料液比（g/mL）1∶20加入60%乙醇20mL，充分搖勻后，在40℃、40kHz避光超聲提取1、2、3、4、5h，抽濾提取液，將濾液轉(zhuǎn)至20mL容量瓶?；靹蚝笕〕?.1mL于100mL容量瓶中，立即測定其多酚含量。

1.4 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時間進行綜合考慮，采用三因素三水平，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計法設(shè)計響應(yīng)面實驗，分析費菜多酚在不同提取條件下的含量，從而優(yōu)化出最佳提取條件。實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.5 驗證實驗

以費菜為材料，按照Design Expert軟件中的Box-Behnken Design模型得到優(yōu)化的提取條件，設(shè)計三組平行實驗，立即測定提取液中的多酚含量，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用Folin-Ciocalteu法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得沒食子酸含量（X）與吸光值（Y）之回歸方程方程Y=0.1308X+0.013，R2=0.9991，見圖1。實驗結(jié)果表明，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度在（1～8）μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對費菜多酚提取液中含量的影響 如圖2所示，在溫度40℃，料液比1∶20（g/mL），40kHz避光超聲浸提2h的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對費菜多酚含量的影響。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，提取液中多酚含量上升趨勢明顯，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，提取液中多酚含量達最大值，之后隨著體積分?jǐn)?shù)的增大，含量反而降低。所以最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)確定為60%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對費菜多酚提取液含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from Sedum Aizoon Linn

2.2.2 液料比對費菜多酚提取液含量的影響 如圖3所示，在溫度40℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，40kHz避光超聲浸提2h的條件下，液料比對費菜多酚含量的影響。提取液中多酚物質(zhì)含量隨著溶劑量的增加而增加，當(dāng)料液比達到1∶25后，隨著料液比繼續(xù)增大，提取液中的多酚含量增加緩慢，且有下降趨勢。根據(jù)濃度梯度 是 提 取 的 動 力[13]，提 高 料 液 比 雖 然 有 利 于 多 酚 的提取，但當(dāng)料液比達到某一極限時，再提高料液比收效不大。由結(jié)果分析，并考慮到節(jié)約能源，所以最佳料液比確定為1∶25。

圖3 液料比對費菜多酚提取液含量的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from Sedum Aizoon Linn

2.2.3 提取溫度對費菜多酚提取液含量的影響 如圖4所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%，料液比1∶20（g/mL），40kHz避光超聲浸提2h的條件下，提取溫度對費菜多酚含量的影響。當(dāng)溫度達到40℃時，提取液中多酚的含量達到最大，之后隨著溫度的升高含量反而降低。溫度是影響提取的重要因素之一，在一定的溫度范圍，提高溫度可能有利于多酚的提??；但是由于多酚中含有大量的酚羥基，其化學(xué)性質(zhì)十分活潑，而某些酚 類 物 質(zhì) 在 較 高 的 溫 度 下 不 穩(wěn) 定[14]，故 當(dāng) 提 取 溫 度超過40℃時，費菜多酚的含量隨著溫度的升高反而降低。所以確定最佳提取溫度確定為40℃。

圖4 提取溫度對費菜多酚提取液含量的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate of polyphenols from Sedum Aizoon Linn

2.2.4 提取時間對費菜多酚提取液含量的影響 如圖5所示，在溫度為40℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液1∶20（g/mL），40kHz避光超聲浸提的條件下，提取時間對費菜多酚含量的影響。費菜提取液中多酚含量在2、3、4、5h時顯著高于1h（p＜0.05）；當(dāng)提取時間超過2h后，延長提取時間，提取液中多酚含量無顯著差異（p＜0.05），但呈下降趨勢。由于多酚易氧化[15]，提取時過長會破壞多酚類物質(zhì)的酚羥基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其含量降低[16]。所以，最佳提取時間確定為2h。

圖5 提取時間對費菜多酚提取液含量的影響Fig.5 Effect of time on extraction rate of polyphenols from Sedum Aizoon Linn

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化費菜多酚提取工藝

2.3.1 響 應(yīng) 面 分 析 因 素 水 平 的 選 取 根 據(jù) Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理[17]，并結(jié)合上述單因素影響的實驗結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和提取溫度（C）3個影響因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析方法，共17個實驗點。由Box-Behnken Design設(shè)計方案所得的實驗結(jié)果見表2。

2.3.2 數(shù)學(xué)模型的建立 按照Design Expert軟件中的Box-Behnken Design模型對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到多酚含量對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）的二次多項回歸模型為：Y=61.68+ 0.86A-0.18B+0.33C+0.11AB-0.075AC-0.045BC-2.89A2-1.67B2-1.38C2，對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken設(shè)計方案及其響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and correspondingexperimental polysaccharide yields

表3 費菜多酚提取參數(shù)數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis of extraction factors for Sedum Aizoon Linn-polyphenols

由表3可知，整體模型顯著性水平p＜0.01，表明二次方程模型達到極度顯著水平；同時失擬項p= 0.3959＞0.05，表明差異不顯著，殘差均由隨機誤差引起。綜合以上所述，說明模型擬合程度良好，實驗誤差小。因此，該模型可較好地描述各因數(shù)與相應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可利用模型來分析和預(yù)測費菜多酚的提取工藝結(jié)果。對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）及其二次項（A2）、料液比二次項（B2）、浸提溫度二次項（C2）對費菜提取液多 酚含量有高度顯著影響；料液比（B）、浸提溫度（C）、交互項AB，AC，BC對費菜提取液多酚含量的影響均不顯著（p＞0.05）；依據(jù)系數(shù)估計值A(chǔ)=0.86、B=-0.18、C=0.33可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞浸提溫度＞料液比。

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 利用Design Expert 7.1.6軟件，繪制各影響因素對費菜多酚含量的響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)面的形狀，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和浸提溫度（C）對費菜多酚含量的影響。如果一個響應(yīng)曲面坡度相對平緩，表明其可以忍受處理條件的變異，而不影響到響應(yīng)值的大小，相反，如果一個響應(yīng)曲面坡度異常陡峭，表明響應(yīng)值對于處理條件的改變非常敏感。比較圖6的曲面圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)A對費菜提取液多酚含量的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而料液比B和提取溫度C次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，料液比的影響最小，結(jié)果與方差分析相似。

圖6 各參數(shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plot of all arguments

2.3.4 優(yōu)化與驗證 從上述回歸模型中求得最優(yōu)工藝條件為A=0.68、B=-0.03、C=0.10，即最佳浸提條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)66.80%，料液比1∶24.85，溫度41℃，費菜提取液多酚含量的理論值為60.9477mg/g。

為了操作方便，將以上條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)67%、料液比1∶25、提取溫度41℃。驗證實驗結(jié)果表明，在最佳提取條件下，費菜提取液多酚含量為60.90mg/g（RSD=0.36%），與預(yù)測值相差不大，說明該方程與實際情況擬合很好，驗證了所建模型是合理可靠的。

3 結(jié)論

建立了一個以多酚提取率為目標(biāo)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度為因子的數(shù)學(xué)模型，方差分析表明其擬合良好，通過實驗得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為：浸提時間2h，乙醇體積分?jǐn)?shù)67%、料液比1∶25（w/v）、提取溫度41℃，在此條件下，費菜多酚提取液含量可達60.90mg/g。說明響應(yīng)面法適用費菜多酚提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

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Optimization of polyphenol extraction from Sedum Aizoon L. by response surface methodology

ZHOU Wen，QIANG Yi，LU Xiu-lan，WANG Zhe-zhi*
（Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China，College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Objective：The main research object was Sedum Aizoon L.Besides，an optimization of extraction process for from Sedum aizoon L.was established.Methods：Based on the single factor analysis，a 3-factor，3-level Box-Behnken experimental design was applied to evaluate the effect of the three factors ，including ethanol concentration，ratio of material to liquid and extraction temperature．Results：The optimal extraction conditions were ethanol concentration of 67% （v/v），extraction temperature 41℃ ，extraction time 2h，solid-toliquid ratio 1∶25 （w/v ）.Under such extraction conditions，the experimental yield of polyphenols obtained after the first extraction was up to 60.90mg/g ，which was close to the model-predicted value.Conclusion ：The established regression equation for polyphenols yield had an excellent goodness of fit.Therefore it was credible and could be used for practical prediction.

Sedum Aizoon Linn；polyphenols；response surface methodology

TS201.2

B

1002-0306（2014）22-0249-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.046

2014－03－11

周文（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：植物生物技術(shù)。

* 通訊作者：王喆之（1958-），男，博士，教授，研究方向：植物生物技術(shù)。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（GK201402030）。