大米黑曲霉的微波殺菌工藝優(yōu)化

徐艷陽，李科靜，仇 洋，鄭 麗

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春 130022）

大米黑曲霉的微波殺菌工藝優(yōu)化

徐艷陽，李科靜，仇 洋，鄭 麗

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春 130022）

為了探討微波處理對大米霉菌的殺滅效果，以黑曲霉為研究對象，應(yīng)用響應(yīng)面法對大米中黑曲霉的微波殺菌工藝進行優(yōu)化研究，考查微波功率、微波時間和菌懸液體積對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響，并建立相應(yīng)的模型。結(jié)果表明最佳工藝條件為：微波功率231W、微波時間4min、菌懸液體積97mL，在此條件下黑曲霉孢子減少對數(shù)周期為4.8920±0.0882，實際值與理論值的相對誤差為4.37%。與水浴加熱法相比，微波法的殺菌效果是其殺菌效果的8.5倍。

大米，黑曲霉，微波，殺菌，響應(yīng)面法

稻谷是我國主要的糧食作物之一，年產(chǎn)量約1.85億t[1]，折合大米1.26億噸，約占糧食總產(chǎn)量的40%。我國每年因大米霉變造成的損失約100萬噸[2]，引起大米霉變的菌屬主要有青霉屬、曲霉屬、根霉屬和鐮刀霉屬，其中青霉屬和曲霉屬是優(yōu)勢菌屬，產(chǎn)生毒素的主要是曲霉屬和鐮刀霉屬[3-5]。黑曲霉是曲霉屬中一個常見菌種，在糧食中廣泛存在[6]。在高溫、高濕環(huán)境下儲藏，糧食中的霉菌就極容易大量生長繁殖產(chǎn)酶生熱，且在代謝過程中還會產(chǎn)生毒素，嚴重危害人體的健康[7-8]。

微波是指頻率為300MHz~300GHz之間的電磁波，利用微波殺菌是近年來新興的殺菌方法之一，因其在殺菌過程中具有快速、高效、安全、環(huán)保等特點[9-10]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品工業(yè)[11-13]。目前，國外學(xué)者Lee KY等[14]研究了微波誘導(dǎo)的氬等離子體對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用；Hamoud-Agha M M等[15]研究了大腸桿菌的微波失活；Fang Y P等[16]研究了低劑量的微波輻射對大米中寄生曲霉的殺菌作用 ；張 習(xí) 軍 等[17]研 究 了 微 波 處 理 對 大 米 的 加 工 、食用、儲藏等品質(zhì)的影響；胡堅[5]對微波殺滅大米中寄生曲霉的機理進行了探究，但對大米中黑曲霉的微波殺菌作用方面的研究尚未見報道。因此，本文針對大米中黑曲霉進行微波殺菌工藝研究，擬將微波殺菌應(yīng)用到大米防霉過程中，避免傳統(tǒng)的化學(xué)方法如藥劑熏蒸帶來的藥物殘留和污染問題，以及物理方法如低溫氣調(diào)儲藏成本高等缺點，為糧食儲藏高質(zhì)量、高營養(yǎng)、高效益、低損耗、低污染的目標提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉 吉林大學(xué)食品微生物實驗室從大米中分離、鑒定得到；磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、苯酚、氯化鈉、無水乙醇、氯化鉀 北京化工廠；瓊脂 海南省瓊海長坡瓊青瓊脂廠；蔗糖、硝酸鈉 西隴化工股份有限公司；硫酸鎂 天津市光復(fù)精細化工研究所；甘油、吐溫-80 天津市華東試劑廠；所用試劑 均為分析純。

MM721AAU-PW美的微波爐 美的微波電器制造有限公司；JA3003A電子精密天平 上海精天電子儀器有限公司；LD4-2A低速離心機 北京雷勃爾離心機有限公司；DSX-280A不銹鋼手提式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP060恒溫培養(yǎng)箱 上海實驗儀器廠有限公司；DMXY數(shù)碼生物顯微鏡 浙江寧波舜寧儀器有限公司；SW-CJ-1DF潔凈工作臺 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；QL-901試管振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市恒豐儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑曲霉孢子菌懸液的制備 將斜面保藏的黑曲霉轉(zhuǎn)接至平板中，28℃進行純培養(yǎng)3~5d后，用一定量的洗脫液（體積分數(shù)0.05%吐溫-80、pH為7.0~ 7.2的磷酸鹽緩沖液）將孢子洗至裝有玻璃珠的錐形瓶中，搖勻、用紗布過濾除去菌絲體，4000r/min離心15min后，用0.85%生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)至106CFU/mL備用。

1.2.2 實驗指標 黑曲霉微波殺菌效果采用孢子減少對數(shù)周期（Y）表示：

式中，N為經(jīng)微波處理后的菌落數(shù)（CFU/mL），N0為初始的菌落數(shù)（CFU/mL），黑曲霉菌落計數(shù)按照GB4789.15-2010。

1.3 單因素實驗設(shè)計

1.3.1 微波功率對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響 量取5份100mL黑曲霉孢子菌懸液，在119、231、385、539、700W條件下微波4min后，測其菌落數(shù)，計算孢子減少對數(shù)周期。

1.3.2 微波時間對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響 量取5份100mL黑曲霉孢子菌懸液，在119W功率下，分別處理2、4、6、8、10min后，測其菌落數(shù)，計算孢子減少對數(shù)周期。

1.3.3 菌懸液體積對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響 在119W功率下，菌懸液體積分別為50、100、150、200、250mL微波4min后，測其菌落數(shù)，計算孢子減少對數(shù)周期。

1.3.4 響應(yīng)面實驗優(yōu)化設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以微波功率、微波時間、菌懸液體積作為考察因素，黑曲霉孢子減少對數(shù)周期為指標，采用Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計進行優(yōu)化研究，各因素水平設(shè)計及編碼見表1。

1.4 水浴加熱法殺菌對比實驗設(shè)計

1.4.1 微波殺菌法 量取3份97mL菌懸液，在微波時間4min、微波功率231W條件下進行處理后，測其菌落數(shù)，計算3次處理黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的平均值。

1.4.2 水浴加熱法 將水浴溫度升至87℃，取3個裝有97mL菌懸液的錐形瓶，水浴加熱4min后，計算3次處理的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每次實驗重復(fù)三次，采用Excel2007軟件計算平均 值 、標 準 偏 差 及 繪 圖 ，采 用 SPSS17.0和 Design-Expert 8.05軟件進行數(shù)據(jù)分析。

表1 實驗因素水平編碼表Table 1 Coded variables and levels of facters

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 微波功率對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響 在菌懸液體積、微波時間相同的條件下，考察不同的微波功率對黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 微波功率對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響Fig.1 Effects of microwave power on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

由圖1可知，微波功率與黑曲霉孢子減少對數(shù)周期呈正相關(guān)趨勢，通過方差分析，微波功率對黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響顯著（p＜0.05）。經(jīng)LSD多重差異比較分析，385、539、700W之間差異不顯著（p＞0.05），當微波功率為385W時，菌懸液在殺菌過程中開始出現(xiàn)沸騰和沖出現(xiàn)象。因此從實驗的準確性和可實施性角度考慮，微波功率選231W較佳。

2.1.2 微波時間對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響 在菌懸液體積、微波功率相同的條件下，考察不同的微波時間對黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著微波時間的增長，黑曲霉孢子減少對數(shù)周期逐漸增大，通過方差分析，微波時間對黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響顯著（p＜0.05）。當微波時間為6min時，菌懸液開始出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象并有液體沖出，菌懸液體積減少約10mL。因此，從實驗的準確性考慮，選4min為較佳微波時間。

2.1.3 菌懸液體積對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響 在微波時間、功率相同的條件下，考察不同的菌懸液體積對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，菌懸液體積與黑曲霉孢子減少對數(shù)周期呈負相關(guān)趨勢，通過方差分析，菌懸液體積對黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響顯著（p＜0.05）。經(jīng)LSD多重差異比較分析，50與100mL、200與250mL之間差異不顯著（p＞0.05）；100、150、200mL之間差異顯著（p＜0.05），當菌懸液體積為50mL時，菌懸液在殺菌過程中出現(xiàn)沸騰和液體沖出現(xiàn)象。因此，選100mL為較佳菌懸液體積。

圖2 微波時間對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響Fig.2 Effects of microwave time on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

圖3 菌懸液體積對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響Fig.3 Effects of mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化與分析

2.2.1 回歸方程的建立及顯著性檢驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 8.05軟件對各因素及水平進行設(shè)計，實驗結(jié)果見表2和表3。

應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到黑曲霉孢子減少對數(shù)周期（Y）與微波功率（A）、微波時間（B）、菌懸液體積（C）的二次回歸方程為：

Y=+5.10+0.40A-0.28B+0.43C-1.45AB+1.83AC+ 2.27BC-1.98A2-1.42B2-1.10C2

由表3可知，決定系數(shù)R2=0.9953，說明該模型擬合程度較好，p＜0.0001表明該模型有非常高的顯著性，失擬項p=0.1602＞0.05不顯著，表明該模型不失擬，可以用于大米黑曲霉微波殺菌工藝優(yōu)化的研究；從回歸方程中一次項的方差分析中可知，微波功率、微波時間和菌懸液體積對黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響為極顯著；從交互項方差分析中得出微波時間和菌懸液體積的交互作用、微波功率和微波時間、微波功率和菌懸液體積交互作用極顯著。

表2 實驗結(jié)果Table 2 Results of experiments

表3 二次回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA for quadratic regression equation

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程來繪制交互作用較為明顯的響應(yīng)面立體分析圖，結(jié)果見圖4~圖6。

由圖4可知，隨著微波功率的增加，黑曲霉孢子減少對數(shù)周期先增后減；隨著微波時間的延長，黑曲霉孢子減少對數(shù)周期先增后減，且因微波功率曲面較陡，所以微波功率對黑曲霉孢子減少對數(shù)周期的影響較微波時間顯著。等高線的形狀反映出兩因素交互作用的強弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著，由圖4中等高線圖可以看出，微波時間和微波功率的交互作用顯著。

圖4 微波功率與微波時間對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of effects of microwave power and microwave time on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

圖5 微波功率與菌懸液體積對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of effects of microwave power and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

圖6 微波時間與菌懸液體積對大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots of effects of microwave time and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

由圖5可知，隨著微波功率的增加，黑曲霉孢子減少對數(shù)周期先增后減；隨著菌懸液體積的增多，黑曲霉孢子減少對數(shù)先增后減，且菌懸液體積曲面較陡，菌懸液體積較微波功率影響顯著。等高線圖呈橢圓形，所以菌懸液體積和微波功率的交互作用顯著。

從圖6看出，隨著菌懸液體積的增多，黑曲霉孢子減少對數(shù)周期逐漸減小，隨著微波時間的延長，黑曲霉孢子減少對數(shù)周期呈逐漸增大的趨勢，因菌懸液體積曲面較陡，菌懸液體積較微波時間影響顯著。由圖6中等高線圖呈橢圓形可知，菌懸液體積和微波時間的交互作用顯著。

通過響應(yīng)面分析可知，影響微波殺菌的因素大小順序為：菌懸液體積＞微波功率＞微波時間。當微波功率264W、微波時間3.39min、菌懸液體積96.94mL時，黑曲霉孢子減少對數(shù)周期達到理論最大值5.1153。

2.3 驗證實驗

實際設(shè)備的功率最大可達231W，所以考慮到實際操作性，對理論值進行修正：微波功率231W、微波時間4min、菌懸液體積97mL此時大米黑曲霉孢子減少對數(shù)周期為4.8920±0.0882，與理論值相差4.37%，表明用響應(yīng)面法優(yōu)化得到大米中黑曲霉微波殺菌的工藝條件是可靠的。

2.4 對比實驗

微波殺菌法和水浴加熱法對比實驗結(jié)果值見表4。

表4 微波殺菌法和水浴加熱法對比實驗（n=3）Table 4 Comparative experiment of microwave treatment andwater-bath heating treatment（n=3）

水浴加熱處理后的黑曲霉孢子減少對數(shù)周期為0.5764±0.0043；微波法處理后的黑曲霉孢子減少對數(shù)周期為4.8920±0.0882。因此，微波法的殺菌效果是水浴加熱法的8.5倍。

3 結(jié)論

采用三因素三水平響應(yīng)面法對大米中黑曲霉微波殺菌工藝進行優(yōu)化研究，獲得微波殺菌的最佳條件為：微波功率231W、微波時間4min、菌懸液體積97mL。通過三次驗證實驗，測得黑曲霉孢子減少對數(shù)周期為4.8920±0.0882，實際測定值與理論預(yù)測值的相對誤差為+4.37%。與水浴加熱法相比，微波法的殺菌效果是其8.5倍。

[1] 萬鵬. 大米品質(zhì)檢測系統(tǒng)研究[D].長春：吉林大學(xué)，2009.

[2] 陳偉暢. 大米天然防霉保鮮劑的研究[D]. 無錫：江南大學(xué)，2008.

[3] 謝剛.糧食污染主要真菌毒素的研究[D]. 成都：四川大學(xué)，2005.

[4] 吳磊，高群玉，石英. 大 米儲藏保鮮 技術(shù)研究新進展[J]. 糧油食品科技，2008，16（6）：4-7.

[5]胡堅.寄生曲霉的微波效應(yīng)研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6] 齊祖同. 中國真菌志-曲霉屬及其相關(guān)有性型[M]. 北京：科學(xué)出版社，1997：99-101.

[7] 張東杰，王穎，翟愛華. 大米質(zhì)量安全關(guān)鍵控制技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2011：62-63.

[8]Tanaka K J，Sago Y K，Zheng Y Z，et al.Mycotoxins in rice [J].International Journal of Food Microbiology，2007，119（1-2）：59-66.

[9]Terigar B G，Balasubramanian S，Boldor D，et al.Continuous microwave-assisted isoflavone extraction system：Design and performance evaluation[J].Bioresource Technology，2010 ，101（7）：2466-2471.

[10]Ribeiro D G，Pavarina A C，Dovigo L N，et al.Denture disinfection by microwave irradiation：A randomized clinical study [J].Journal of dentistry，2009，37（9）：666-672.

[11]Dorantes-Alvarez L，Jaramillo-Flores E，González K，et al. Blanching peppers using microwaves[J].Procedia Food Science，2011，1：178-183.

[12]Cendres A，Chemat F，Maingonnat J F，et al.An innovative process for extraction of fruit juice using microwave heating[J]. LWT-food science and technology，2011，44（4）：1035-1041.

[13]Matsuia K N，Granadob L M，DE Oliveira P V，et al. Peroxidase and polyphenol oxidase thermal inactivation by microwavesin green coconut water simulated solutions[J].LWT-food science and technology，2007，40（5）：852-859.

[14]Lee K Y，Park B J，Lee D H，et al.Sterilization of Escherichia coli and MRSA using microwave-induced argon plasma at atmospheric pressure[J].Surface and Coatings Technology，2005，193（1-3）：35-38.

[15]Hamoud-Agha M M，Curet S，Simonin H，et al.Microwave inactivation of Escherichia coli K12CIP 54.117 in a gel medium：Experimental and numerical study[J].Journal of Food Engineering，2013，116（2）：315-323.

[16]Fang Y P，Hu J，Xiong S B，et al.Effect of low-dose microwave radiation on Aspergillus parasiticus[J].Food Control，2011，22（7）：1078-1084.

[17] 張習(xí)軍，熊善柏，趙思明. 微波處理對稻谷品質(zhì)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（1）：224-229.

Process optimization of microwave sterilization for Aspergillus niger from rice

XU Yan-yang，LI Ke-jing，QIU Yang，ZHENG Li
（College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，China）

In order to explore the killing effects of microwave treatment on molds from rice ，response surface methodology was used to optimize process of microwave sterilization Aspergillus niger from rice.Effect of microwave power， microwave time ，and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice were investigated，and corresponding regression equation was established.Results showed that optimum sterilization conditions were as follows：microwave power of 231W，microwave time of 4min，and mould suspension volume of 97mL.Under these conditions，log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger was 4.8920±0.0882 ，relative error between determined and predicted value of log-periodic reduction of spores was 4.37%.Compared with water-bath heating treatment，effect of microwave sterilization was 8.5 times as much.

rice；Aspergillus niger；microwave；sterilization；response surface methodology

TS210

B

1002-0306（2014）22-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.045

2014－02－13

徐艷陽（1972-），女，博士，副教授，主要從事食品營養(yǎng)與安全方面的研究。

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20120717）；吉林大學(xué)本科教學(xué)改革研究項目（2013138）；吉林大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費項目（450060487501）。